MICROSCOPIE QUANTITATIVE ( … enfin presque !)
par J.M. Cavanihac


Tout microscopiste amateur (ou non !) s'est un jour posé la question de connaître la taille de ce qu'il observe . Pour un microscope le grossissement total est donné par le produit du grossissement de l'objectif par celui de l'oculaire. C'est très bien en théorie , mais qu'advient-il après l'adaptation plus ou moins sophistiquée d'une caméra sur le tube du microscope ?.

Il existe des micromètres objets (que l'on mets donc à la place de l'objet ) et des micromètres oculaires (qui sont installés à demeure entre les deux lentilles de ce dernier ). En général les micromètres oculaires doivent être étalonnés à partir d'un micromètre objet en fonction des objectifs utilisés: deux graduations espacés d'1/100 de mm sur l'objet correspondent par exemple à 23 graduations du micromètre oculaire, ce qui ne rend pas franchement commode la conversion surtout lorsqu'on change d'objectif et ne permet pas d'en garder la trace sur l'image.

Mais il existe une autre solution, relativement précise, à la portée de tout le monde pourvu que vous ayez un logiciel de traitement d'image (dessin) (même rustique) et quelques couvre objets. Bien entendu le processus est le même si vous avez un micromètre objet comme référence ou une lame de comptage divisée en carrés genre Malassez, Nageotte...

  Les couvre objets ont environ 0,17 mm d'épaisseur. Mais on peut être un peu plus sûr de leur épaisseur moyenne en en empilant une trentaine (ce qui devrait nous faire 5,1 mm d'épaisseur ) , que l'on peut contrôler avec un double décimètre ou mieux un pied à coulisse. Si par exemple on trouve 5,4 mm c'est qu'ils font 0,18 mm en réalité.

Posons un de ces couvre objets verticalement sur une lame en le fixant par une boulette de mastic ou mie de pain et faisons la mise au point (attention de ne pas descendre l'objectif trop vite …sinon casse assurée! ) sur sa tranche . Prenez une photo et, sur l'écran de l'ordinateur, dans votre logiciel de visualisation favori, mesurez (avec le double décimètre) la taille de cette tranche très grossie. Dans mon cas avec l'objectif de 15 et tous les divers grandissements dus à l'adaptation de la caméra je trouve 69 mm

Ci dessus avec objectif 6,3 x et 15 x à droite
J'ai donc un grandissement réel de 69/0,17 soit 405 fois ! Ce qui veut dire aussi que 0,1 mm sur l'objet correspond à 40,5 mm sur l'écran. Il suffit alors de tirer sur l'image un trait de 40,5 mm avec le logiciel de dessin/visu, de le copier dans un nouveau fichier et d'écrire à côté : 0,1mm avec objectif 15 x.

Recommencez avec les autres objectifs et vous créez un fichier documentaire (BMP ou Jpg) avec les divers grandissements (voir ci contre ). Pour les objectifs de faibles grossissement vous pouvez observer 5 couvre objets accolés pour augmenter la précision.

Vous pouvez ensuite sub diviser l'échelle pour l'adapter à la taille de la photo.

Dans vos prochaines images (obtenues dans les mêmes conditions ) il suffira de copier (copy/paste) la longueur de trait correspondant au grandissement de l'objectif employé pour disposer d'une échelle fiable (à mieux que 10%) . Bien entendu insérez l'échelle avant toute manipulation de l'image : notamment Resize et Resample !. (juste un mot : la fonction Resample est en général préférable à Resize car elle réalise une interpolation des pixels manquant ou restant au lieu de les dupliquer ou de les supprimer comme fait Resize)

Pour les lecteurs qui voudraient approfondir la notion de mesures diverses, je signale le logiciel GRATUIT ImageJ, téléchargeable au National Institute of Health http://rsb.info.nih.gov

(en versions Mac et PC) : il s'agit d'un vrai logiciel de mesure scientifique, avec calibration d'échelle, mesure surfaces, comptage d'objets, profils de densité (optique), manipulation de piles d'images, sommation/moyennage d'images (par exemple à divers niveaux de focalisation..), rendu 3D et j'en passe…

Auriez vous pensé (sans l'échelle) que ce long Chaetognate (Arrow Worm) trouvé dans du plancton marin mesurait prés de 3 mm de long ? Image échelle 1/2 obtenue avec 8 images élémentaires.