*  Généralités relatives à  LA   FIXATION  *  
 

Cet Article de Marcel LECOMTE est le miroir de l'article original que vous pouvez retrouver sur le site

CHAMPIGNONS-PASSION
 
 


par Marcel LECOMTE

 
 

 

Elle consiste à immobiliser (tuer) les cellules, en les conservant le plus possible dans un état proche du vital, avec un minimum de déformations. Une cellule morte va accepter la coloration qui était quasi impossible ou très aléatoire de son vivant. La fixation agit par coagulation ou précipitation de certains composants cellulaires.

 

Entreprendre une théorie générale de la fixation serait illusoire dans le cadre de ce travail, et cela a été réalisé de la meilleure manière par nos maîtres, Maurice LANGERON et Marcel LOCQUIN.

 

Il est essentiel de savoir au départ quels types de sujets nous allons traiter, car les techniques seront différentes :

·        histologie et cytologie animales, après prélèvements sur des gros sujets

·        étude des Protozoaires et autres animaux microscopiques (uni- ou pluricellulaires)

·        frottis divers

·        parasitologie et mycoses

·        histologie et cytologie végétales

·        mycologie

 

Nous nous contenterons de tenter une approche de 2 sujets qui ne nous sont pas tout à fait étrangers : la cytologie végétale et la mycologie !

Nous avons d’ailleurs le sentiment que les techniques appliquées à ces deux disciplines sont sensiblement plus abordables et plus simples, car exigeant moins de manipulations et présentant moins de cas particuliers.

La plus grosse difficulté, à notre avis, consiste à effectuer un choix parmi la panoplie énorme de techniques, produits et réactifs, qui nous sont offerts… il y a de quoi y perdre son latin ou la tête !

 

Pourquoi fixer ?

·        pour rendre les constituants cellulaires insolubles

·        pour durcir les membranes et les composants cellulaires

·        pour augmenter l’indice de réfraction des pièces et conduire ainsi à une meilleure différenciation optique (c’est le fait de la coagulation des albuminoïdes formant la masse cellulaire).

·        pour permettre simplement une meilleure observation (la fixation nous paraît importante sinon essentielle, que les préparations soient ponctuelles ou à destination définitive).

 

Un choix important doit s’effectuer au départ, selon la destination de la préparation.

Avons-nous l’intention d’utiliser :

·        un fixateur coagulant

·        un fixateur non coagulant

 

 

 

A-1   Les fixateurs coagulants simples

 

Nous en retiendrons trois :

 

·        l’ ETHANOL absolu  ou ALCOOL ETHYLIQUE absolu : il ne nous satisfait guère, en raison de son prix exorbitant, de la difficulté extrême de le conserver « absolu » de par son hygroscopie très élevée (car il est tellement hygroscopique que dès qu'on ouvre le flacon il absorbe l'humidité de l'air et n'est donc plus "absolu" - sa conservation implique l'utilisation d'un flacon spécial avec un déshydratant puissant, comme le sodium, et relève d'un laboratoire)  à aussi, oublions le !

 

·        l’ ETHANOL ou ALCOOL ETHYLIQUE à 95° : comme le précédent, il durcit très fort les tissus. Il coagule très bien les protéines mais ne fixe pas les graisses  (les lipides sont solubles dans l’alcool) ni les sucres (parmi les hydrates de carbone, seul le glycogène est fixé).

 

·        le TRINITROPHENOL ou ACIDE PICRIQUE : il est à la fois fixateur et colorant (jaune). A manipuler avec précaution, car c’est un explosif lorsqu’il est chauffé. Il ne durcit quasi pas les tissus.

 

Nous leur préférons des mélanges fixateurs où certains composants se complètent..

 

A-2.  Les fixateurs non coagulants simples (ils sont nettement plus efficaces que les fixateurs coagulants)

Nous en retiendrons deux :

 

·        le FORMALDEHYDE ou METHANAL (dans le commerce, il est vendu sous le nom de FORMOL : attention  car la solution commerciale est impure … voir notre fiche technique à ce sujet !)

Il présente beaucoup de qualités à nos yeux :

·        il fixe les lipides

·        il ne contracte pas les tissus

·        il durcit fortement les tissus

·        c’est un excellent fixateur, surtout si on l’additionne de sucre ou d’un sel

·        il n’est pas nécessaire de laver la préparation pour la suite des opérations

·        par contre, il est incompatible avec la paraffine (s’il s’agit de pratiquer une inclusion)

          

Walter DIONI a émis de nettes réserves quant à son utilisation en milieu professionnel, pour des raisons évidentes et justifiées de prévention sanitaire, car les techniciens de laboratoire sont exposés aux vapeurs diverses à longueur de journée et d’année.

Nous le citons :

… «  Il y a peu d'années, a commencé la tendance à souligner les périls de beaucoup de substances utilisées normalement en microscopie depuis plus d’un siècle. Successivement ont été dénoncés : le formol, le glutaraldéhyde, le dichlorure mercurique, l’acide picrique, l’hydrate de chloral, l’acide phénique, le thymol, le violet de gentiane (ou cristal violet), le rose Bengale, le xylol, le benzol, le toluol, (xylène, benzène, toluène ) etc. etc..

La courte liste précédente prive d’ingrédients presque toutes les formules traditionnelles des réactifs pour la microscopie comprenant des fixateurs, des colorants, des agents éclaircissants et des milieux de montage. … »…

Cependant, dans le cadre de nos activités de loisir réduites à quelques heures par semaine, le danger d’exposition est beaucoup moindre et quasi insignifiant, surtout si vous prenez la peine de travailler dans une pièce bien aérée :ventilation naturelle (fenêtre ouverte) ou forcée (extracteur d’air). A partir du moment où vous manipulez des produits à forte concentration (si vous préparez vous même  vos réactifs, fixateurs, colorants …..!), nous conseillons vivement l’installation dans votre laboratoire, d’une petite hotte de cuisine, dont on ferme également les 2 parois latérales.

 

·        l’ACIDE ACETIQUE (il est dit « glacial » lorsqu’il est anhydre) ; on l’utilisera en solution aqueuse à 5 %. Nous lui préférons de loin le précédent, s’il est utilisé seul !

 

B.   Les mélanges fixateurs  (il en existe beaucoup et certains à destination très ciblée) . Notre choix s’est porté sur des mélanges dont les composants ne sont pas trop coûteux et peuvent être trouvés assez facilement.

Nous utilisons , selon les circonstances :

·        le fixateur de Duboscq-Brasil (mycologie)

·        le fixateur de Hollande ou de Bouin-Hollande (mycologie)

·        le fixateur de Carnoy (convient bien pour observer les chromosomes et la mitose)

·        le fixateur de Locquin (histologie végétale)

·        le fixateur de Halmi (mycologie)

·        le fixateur lactocuprique (Protozoaires, Rotifères, Algues…)

·        le fixateur GALA de Dioni (Protozoaires, Rotifères, Algues…)

·        l’alcool formolé acétique (formule passe partout)

 

 Tous ces mélanges portent en général le nom de leur inventeur, et certains sont très voisins. Pour les compositions précises et les destinations spécifiques, voir les fiches techniques qui s’y rapportent !

 

 

 

Passons de la théorie à la PRATIQUE :

 

 

Au départ, il est important de savoir ce qu’on souhaite observer et il est impératif de se poser les questions suivantes :

 

·        suis-je intéressé par le contenu cellulaire (cytoplasme, vacuoles, nucléole, noyau) ?  à technique A

 

·        suis-je intéressé par les parois cellulaires (membranes cellulosiques) uniquement ? à technique B

 

 

technique A : Nous nous préoccupons du contenu cellulaire

 

Matériel utilisé : hampe florale de tulipe, après la chute des pétales ; il reste l’ovaire bien gonflé, surmonté d’un pistil à 3 crêtes, encore collant. Coupe transversale.

 

1.      COUPES : nous effectuons des coupes au microtome de Ranvier (assez facile du fait de la rigidité de la pièce florale) ou à main levée (à la loupe binoculaire) ; nous avons pris l’habitude d’en effectuer 20 à 25, ce qui permet au bout du compte, d’en trouver 2 ou 3 qui sont excellentes !

Une astuce : humidifier l’objet à trancher et la lame du rasoir avec de l’eau alcoolisée (à 5-10 %) afin d’éviter que les coupes collent sur la lame.

 

2.      FIXATION : plonger les coupes dans un bain de formaldéhyde de laboratoire, filtré (le formol commercial est fortement déconseillé) ; quantité à utiliser : 5 à 10 cm³ ; les laisser macérer durant 12 à 24 heures dans le bain ! Utiliser un petit récipient qu’il est possible de boucher, afin de ne pas s’exposer inutilement aux vapeurs de formol.

 

3.      RINCAGE : plonger les coupes durant quelques minutes dans 10 cm³ d’eau (nombre d’auteurs préconisent l’inutilité de rincer en présence de formol, mais il nous arrive d’avoir des précipités avec certains colorants)).

4.      COLORATION : verser 5 cm³ d’eau dans un petit vase Bécher ; y déposer les coupes. Verser 10 gouttes de Rouge Neutre et laisser agir durant 24 heures.

La manipulation des coupes s’avère toujours délicate, surtout si elle est très fine. Aussi, si vous souhaitez éviter ces désagréments, il est plus aisé de les coller à l’albumine directement sur la lame porte-objet et d’utiliser une cuvette à coloration.

 

5.      RINCAGE de la coupe colorée

 

6.      OBSERVATION : les noyaux et le cytoplasme sont remarquablement colorés.

 

 

 

technique B : Nous souhaitons étudier les parois cellulaires

 

Matériel utilisé : tige d’ Anthriscus sylvestris (L.) Hoffm. (nom vernaculaire : Persil d ‘Ane ou Cerfeuil sauvage) ; cette plante de la famille des Apiaceae (Ombellifères) est commune en Belgique, en avril-juin.

 

Voir la technique A pour les étapes semblables…

 

1. COUPES

 

2. DESTRUCTION du contenu cellulaire : cela se réalise à l’aide d’un bain d’hypochlorite de soude, qui va réduire les tissus végétaux à leur squelette cellulosique ; l’eau de Javel ordinaire n’est pas conseillée, car trop impure ; l’action varie de quelques secondes à 10 minutes, selon l’âge des sujets traités.

 

3. RINCAGE très soigneux : répéter l’opération 2 fois

 

4. FIXATION  à l’éthanol à 95°,  ou à l’acide picrique

 

5. COLORATION :

IL est conseillé d’utiliser la combinaison de 2 colorants différents, qui vont se compléter :

safranine + vert de méthyle,

safranine + Astra Blue,

safranine + bleu de méthyle aqueux,

ou encore carmin aluné + vert d’iode

Exemples pratiques :

·        colorer durant plusieurs heures à la safranine alcoolique ; régresser à l’acide chlorhydrique ; laver ; colorer au bleu de méthyle aqueux tiède ; laver à la cellulose est colorée en bleu et les parties ligneuses sont rouges

·        colorer au carmin aluné ; laver ; colorer au vert d’iode ; laver à la cellulose est colorée en rouge violet et les parties ligneuses sont vert bleuâtre

 

6. RINCAGE de la coupe colorée

 

7. OBSERVATION : les parois cellulaires seront remarquablement colorées selon leur nature (ligneuse ou cellulosique)