La modulation de contraste d'Hoffman

 

 

Le Dr Hoffman a inventé en 1975 aux Etats Unis une remarquable technique d'amélioration du contraste d'objets transparents, colorés ou non, qui met en relief les gradients de phase et les transforme en variations d'intensité lumineuse. Cette technique, appelée modulation de contraste, intéresse l'amateur à plusieurs titres : elle fournit des images magnifiques de sujets aquatiques vivants, souvent plus ou moins transparents, de diatomées et de toutes sortes d'objets dits « de phase », même épais, et contrairement au contraste interférentiel selon Nomarski, elle reste accessible. Je me propose de vous montrer comment modifier vous-mêmes vos objectifs pour observer en modulation de contraste.

Comme pour la plupart des techniques d'amélioration de contraste, l'astuce est de structurer le faisceau de lumière éclairant la préparation par un filtre ou un obturateur partiel, puis d'analyser le faisceau en sortie d'objectif par un autre filtre ou obturateur complémentaire.

Par exemple en contraste de phase, le filtre est un obturateur, le plus souvent un anneau transparent sous le condenseur, le filtre complémentaire prenant la forme d'un anneau opaque ou ¼ d'onde placé dans le plan objet arrière de l'objectif, et recouvrant exactement l'image de l'anneau transparent fournie par l'ensemble condenseur / objectif. En choisissant un filtre en forme d'anneau, on garde la symétrie autour de l'axe optique, et l'on obtient une analyse isotrope des variations d'indice de la préparation.

Mais il est parfaitement possible d'employer d'autres formes. Par exemple, on peut mettre en œuvre un filtre sous condenseur constitué d'une simple fente transparente dans un disque opaque, complémenté en sortie d'objectif par une bande opaque (un morceau de fil métallique rectiligne fait l'affaire). On obtient un système de contraste de phase fortement anisotrope qui fonctionne néanmoins parfaitement

 
 


(voir le site de Erhard Mathias à l'adresse http://www.schwaben.de/home/mathias/emikro/kontrast2.html ). (Voir NOTES )

 
 
Dans la modulation de contraste d'Hoffman, le filtre sous condenseur est une fente large, le plus souvent excentrée, dans laquelle on place un gradient d'absorption optique dans une direction perpendiculaire à la fente. Le filtre en sortie d'objectif est, vous l'aviez deviné, le gradient d'absorption complémentaire, les zones sombres de l'analyseur (appelé dans ce cas modulateur) recouvrant les zones claires du filtre et vice-versa.
 
 

 

Dans la suite de l'article, j'appellerai « filtre » l'obturateur-fente placé sous le condenseur (slit-plate dans la figure 1 ci-contre), et « modulateur » le gradient optique placé au dessus de l'objectif.

 
 

 

 

 
 
Le montage le plus courant est celui de droite, figure 2. Le filtre est dessiné en bas, le modulateur au dessus vient se placer sur l'objectif.
 
       
 

 

J'ai eu la chance de pouvoir acquérir sur le site d'annonces Ebay un objectif Nikon (x20 n=0.40) équipé pour la modulation de contraste d'Hoffman, accompagné du filtre à placer sous le condenseur, ou plutôt sur le condenseur, car cet ensemble était très probablement destiné à un microscope inversé. De fait, ce filtre était inutilisable pour moi, car il était conçu pour un condenseur précis capable de projeter l'image de la fente exactement sur les zones correspondantes du modulateur situé dans l'objectif. J'ai pu cependant examiner comment il était conçu, et en refaire un autre, convenable pour mon microscope.

 
     
 
 
       
 

Le gradient d'absorption dans la fente du filtre est en fait très simplifié : comme le montre le dessin de la figure 2, et les photos, il n'y a que deux zones, une transparente et une grise, formée par une feuille polarisante. Ici, la polarisation n'est utilisée que pour constituer un gris plus ou moins dense, grâce à un autre disque polarisant situé en amont dans le faisceau lumineux.

L'examen de la pupille de sortie de l'objectif à l'aide d'une loupe binoculaire montre que le modulateur est constitué par des plages métallisées directement sur la surface de la lentille de sortie. Il n'y a que deux zones, l'une très sombre, l'autre de densité moyenne.

Fort de ces informations, j'ai donc entrepris de reconstituer, par tâtonnements, la géométrie des fentes claire et polarisante qui convenait au condenseur que j'utilisais sur un microscope russe LOMO. Comme on ne maîtrise pas l'orientation du modulateur, qui dépend in fine du filetage de l'objectif,  il faut orienter le filtre précisément en fonction du modulateur. J'ai commencé par définir la longueur de la fente, peu critique, par deux bandes de ruban autocollant noir (plastique isolant pour électriciens) parallèles et symétriques sur un disque transparent. J'ai ensuite collé une fine bande de film polaroïd sur un autre morceau de plastique noir que j'ai placé perpendiculairement aux deux autres. J'ai ensuite observé le résultat dans le microscope en enlevant un oculaire pour pouvoir observer directement la pupille de sortie de l'objectif et donc le modulateur.

 

 

 
 
 
 

 

On doit voir en sortie d'objectif une image semblable à celle de la figure 3 en haut à droite. La bande claire du filtre doit se superposer exactement à la bande grisée du modulateur. Je n'ai pas essayé les configurations à gauche de la figure, qui sont peut être plus faciles à aligner, mais qui sont censées donner moins de résolution, puisque l'ouverture du faisceau lumineux est réduite. L'ajustement de l'ensemble pour obtenir une parfaite superposition du modulateur et de l'image du filtre est un peu fastidieux, car il faut contrôler à la fois le parallélisme strict des bandes, leur orientation et leur largeur. Comme l'ajustement de largeur des plages d'absorption nécessite la rotation du porte-filtre et le décollement des bandes adhésives, on perd aussitôt les deux autres critères, parallélisme et orientation, que l'on avait difficilement obtenu.

 
     
 
On peut néanmoins, avec un peu de patience, aboutir à un résultat tout à fait convenable en observant à l'œil nu la pupille de sortie de l'objectif. Si vous disposez d'un petit télescope comme on en trouve dans les ensembles de contraste de phase pour agrandir cette image, le travail n'en sera que plus confortable et plus précis. Les possesseurs de microscopes polarisants pourront utiliser la lentille de Bertrand pour le même usage.
 
 
Un exemple de bricolage de filtre.
   
 


Quand j'ai été satisfait de la superposition filtre / modulateur, j'ai replacé l'oculaire et j'ai goûté le plaisir de la première observation, d'une préparation d'insecte entier. L'image était, d'emblée, saisissante, piquée et pleine de détails. Les plis et menus reliefs de la cuticule étaient mis en valeur par un effet de relief doux, sans halo ni artefact, bien supérieur à tout ce que j'avais pu obtenir par l'éclairage oblique ou rasant. Le contraste de phase aurait été inutilisable sur une préparation d'une telle épaisseur, alors que j'avais là une mise en évidence même des variations de densité du médium de montage !

J'ai placé un morceau de film polarisant sur la source de lumière pour faire varier l'absorption de la bande grise du filtre, et j'ai pu observer l'augmentation concomitante du contraste de l'image. Sans assombrissement par la polarisation, on obtient une image fine et contrastée, avec effet de relief, mais douce et naturelle. Quand les polarisants sont croisés, on a un effet dur, à fort contraste, avec une réduction très nette de la profondeur de champ, contrairement à ce que provoque la fermeture d'un diaphragme de condenseur. Les niveaux non focalisés disparaissent vraiment de l'image, de sorte que l'on peut observer successivement la face inférieure d'un insecte, puis les restes musculaires dans la préparation entre les deux couches chitineuses, puis la face supérieure, avec le même contraste !

Les autres préparations essayées m'ont confirmé la remarquable efficacité de ce type d'éclairage. L'effet de relief est vraiment spectaculaire, et très naturel. Il n'y a pas mieux pour observer les amibes et les flagellés vivants (à part peut-être le contraste interférentiel dont je ne dispose pas).

Il faut également signaler la possibilité de combiner l'observation en lumière polarisée et en modulation de contraste. En effet, comme le dispositif situé sous le condenseur comporte un filtre polarisant, il suffit de rajouter dans le faisceau un analyseur et des lames ¼ d'onde pour rajouter des effets de couleurs de polarisation aux effets de relief déjà décrits. On obtient des images parfois spectaculaires, comme en témoignent les photos ci-dessous, extraites du site « Molecular expressions ». (Voir NOTES )

 
 
 
       
 

Ces résultats plus que probants m'ont conduit à vouloir essayer de transplanter cette technique sur un autre microscope plus moderne et plus commode équipé d'objectifs corrigés à l'infini, et pour d'autres grossissements.

Me souvenant avoir observé dans mon enfance une éclipse de soleil avec un morceau de verre noirci à la suie, j'ai eu l'idée, ou l'intuition, que je pourrais réaliser un modulateur en noircissant de cette façon une lamelle couvre-objet ronde.

 
     
 

 

Par chance, les montures de mes objectifs corrigés à l'infini comportent une sorte de feuillure qui reçoit presque sans jeu une lamelle ronde de diamètre 14 mm.

J'ai donc allumé une bougie pour faire mes premiers essais. Ca marche, mais avec des précautions. Il faut que les surfaces soient parfaitement propres pour que le dépôt de suie soit régulier, et il faut éviter les chocs thermiques trop violents qui cassent la lamelle. Le dépôt de suie est extrêmement fragile, et il n'est pas question de l'effleurer de quelque façon que ce soit. Mais ce dépôt est optiquement bien régulier, ce que j'ai vérifié à la loupe binoculaire, et l'on peut obtenir toute la gamme des densités de 0 à 100%.

 
 

 

 

J'ai utilisé comme masque lors du dépôt de suie une autre lamelle rectangulaire. J'ai maintenu les deux lamelles l'une contre l'autre avec des brucelles, et passé le tout dans la flamme de la bougie, par petites passes régulières entrecoupées de phases de refroidissement. Après avoir grisé ainsi un arc sur le coté de la lamelle ronde, j'ai reculé d'un à deux mm selon les cas la lamelle rectangulaire qui servait de masque, sans la changer, en veillant au parallélisme. Puis j'ai renouvelé l'opération en limitant le noircissement à une valeur de gris moyenne. La zone précédemment grisée s'est donc encore assombrie. Enfin je fis glisser délicatement la lamelle ronde partiellement grisée dans la monture de l'objectif, face suie vers le haut pour ne pas la rayer, et remontai l'objectif en le tenant vertical.

 

 

 
 

Vous aurez, comme moi, quelques ratés : Les limites des zones ne seront pas parallèles, ou les proportions, largeurs et densités des gris ne seront pas bien adaptées, ou la couche de suie sera rayée lors des manipulations. Mais les essais sont rapides et les lamelles ne coûtent guère.

Et le jeu en vaut la chandelle ! J'ai pu équiper ainsi des objectifs planachromats de x4, x6.3, x10, x20 et x40, avec un succès complet.

 
 


Il est probable que le modulateur ainsi bricolé n'est pas exactement dans le plan dans lequel se forme l'image du filtre, mais cela ne semble pas avoir une grande importance. Si vous n'arrivez pas à voir l'image du filtre et le modulateur nets ensemble, vous aurez sans doute dans l'image observée à l'oculaire et un champ principal grisé, dans lequel se forme l'effet de contraste recherché,  et un champ clair latéral parasite plus ou moins large. Le montage reste parfaitement utilisable.

Si vous utilisez un illuminateur de Köhler, lorsque vous observez la pupille de sortie de l'objectif, vous devez avoir également dans le même plan l'image du filament de la lampe. Arrangez vous pour qu'au moins une partie du filament soit sur la zone claire du filtre, sinon vous manquerez de lumière, et la variation du contraste sera perturbée.

La proportion de la pupille de sortie qui doit être recouverte par les plages grisées du modulateur conditionne l'efficacité du montage. L'article du site Web cité ci-dessus parle de 10% de la surface, mais comme il est difficile d'apprécier la taille de la pupille de sortie, très variable d'un grossissement à l'autre, par rapport au diamètre de la lamelle utilisée, il faut procéder par essais et erreurs, en tentant de trouver cette proportion au jugé par observation d'une source lumineuse étendue par l'arrière de l'objectif. J'ai essayé de reproduire les proportions de l'objectif Nikon. Vous pouvez également vous référer au dessin ci-avant, dont les proportions sont assez justes.

La densité des gris du modulateur est également importante, et là aussi, il est impossible d'être précis. La bande la plus sombre doit quand même laisser voir en transparence une scène très lumineuse, et la bande moyenne est à peu près à 50%. La photo d'illustration montre une première passe trop sombre. Ce modulateur a été utilisé pour la photo de fin d'article illustrant un modulateur raté, mais qui fonctionne quand même (objectif apo x10). Tâchez d'obtenir une gradation régulière. En clignant des yeux, les plages grisées se fondent, du clair au foncé. Si vous pouvez alors vous imaginer voir le bord d'un objet cylindrique éclairé sur le coté, la gradation est probablement réussie.

De toutes façons, vous observerez la modulation du contraste, même avec un modulateur plus ou moins raté (voir illustration). Mais elle sera peut-être trop dure, se rapprochant du fond noir, ou trop douce, trop semblable à l'éclairage oblique. Un modulateur réussi permet d'utiliser toute la plage de réglage que permet la rotation du filtre polarisant, avec ce magnifique effet allant de la mise en relief douce à la « coupe optique » de la préparation.

Il faut bien sûr réaliser un filtre correspondant à chaque modulateur, pour chaque objectif. Pour éviter que les modulateurs ne bougent dans les montures, j'ai fixé les lamelles, tout au moins celles que j'avais essayées et jugées réussies, par deux points infimes de mastic silicone, diamétralement opposés, entre le métal de la monture et la lamelle, en utilisant un cure-dent en bois. Je dis bien : « infimes ». Il s'agit simplement d'empêcher de bouger une lamelle de quelques dizaines de milligrammes, et il faut pouvoir démonter ! Et vous devez comprendre que si la colle silicone touche la lentille de l'objectif, si peu que ce soit, celui-ci est perdu ! Cette colle est impossible à nettoyer complètement sur le verre.

Une fois les objectifs remontés dans leur barillet, les modulateurs sont parfaitement protégés. Comme ils ne peuvent pas être nettoyés, il faut éviter toute pénétration de poussière dans le microscope, mais cela est vrai dans tous les cas…

Je juge mon objectif x20 à l'infini ainsi bricolé au moins égal, pour ce qui est de la modulation de contraste, au Nikon x20 qui m'avait servi de modèle, sauf pour le respect des couleurs. La suie de bougie n'est en effet pas grise, mais légèrement marron ! Toutes les préparations sont vues comme à travers un filtre bistre léger. J'ai essayé de former la suie par d'autres méthodes, sans pouvoir supprimer cette teinte, qui semble bien être celle du carbone déposé en suie… Si quelqu'un peut suggérer un autre moyen, accessible à l'amateur, pour déposer un gris neutre transparent sur une lamelle, il sera le bienvenu.

Je ne peux que vous encourager à tenter ce bricolage, qui ne nécessite aucun outillage, et qui est assez facile. Les membres parisiens du C.F.M. m'ont vu réaliser la manipulation sur un objectif x40 dans le temps de la réunion. Cette technique est utile à tout grossissement. Je n'ai pas essayé sur un objectif à immersion x100, mais notre collègue Gérard Wastiaux du C.F.M. m'a dit avoir obtenu de bons résultats dans ce cas également.

Si vous pouvez installer une lamelle ronde dans un de vos objectifs, vous pouvez le transformer en objectif pour la modulation de contraste, et réaliser ensuite le filtre correspondant pour votre condenseur. Ce n'est qu'une question de patience, et (un peu) d'habileté.

 

 
 

 Ci-après 5 images comparatives d'une même extrémité de trompe de papillon.

Comme d'habitude, les photographies rendent très mal compte de la qualité et de la vigueur des images vues aux oculaires !

 

 

1- Photo témoin de la trompe de papillon en fond clair, objectif LOMO apo x20.
Sans technique particulière d'amélioration de contraste


2-Image typique hoffman, réglage "doux", au même grossisement.


3-Image au réglage "dur", focus 1 qui montre l'effet de réduction de la profondeur de champ
(effet de coupe optique. )
Focus 1 et 2 : les structures qui sont mises en évidence sont très différentes.

 


4-Image au réglage "dur", focus 2 qui montre l'effet de réduction de la profondeur de champ
(effet de coupe optique. )
Focus 1 et 2 : les structures qui sont mises en évidence sont très différentes.


5-Image x10 avec un modulateur "raté", mais qui donne quand même dans le centre du champ un effet de contraste d'Hoffman très net.

 
Objectif apochromat x10 mal bricolé. Pour montrer ce à quoi on peut s'attendre avec un modulateur raté (champ clair parasite, modulateur trop « dur »). On observe la teinte bistre du fond. Intéressant quand même !

NOTES: Toute la technique est décrite avec beaucoup de clarté et de très belles illustrations sur le site « Molecular expressions. Exploring the world of optics and microscopy » a l'adresse
http://micro.magnet.fsu.edu, en particulier la page
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/hoffman/hoffmanintro.html d'où j'ai extrait les dessins de cet article
Je recommande d'ailleurs ce site tout à fait remarquable, en langue anglaise, où vous pourrez même manipuler des microscopes virtuels utilisant toutes sortes de techniques d'amélioration de contraste.

(NDR): Cet article est paru dans Microgazette, revue du Club français de Microscopie et paraîtra prochainement dans Micscape .
Vous trouverez des références aux travaux d'Erhard Mathias dans les articles de Walter Dioni parus dans ce magazine.
Les références du site de l'Université de l'Etat de Floride (FSU) sont également données dans les Liens du site MicrOscOpieS. Mais si vous trouvez les sites étrangers un peu lointains, si certaines nuances de la langue anglaise vous échappent où si vous voulez dialoguer en français avec des passionnés de microscopie vous pouvez participer aux Forums Mikroscopia .