L'Éosine comme colorant nucléaire en Botanique et comme substitut économique du Carmin en Zoologie
Walter  Dioni                                   Cancún (Q.Roo), Mexique
 

 

Les photos ont été prises en 640 x 480, avec la camera digital de 0.4 Mpx intégrée a mon microscope American Optical, et réduites si besoin pour leur insertion dans l'article. La largeur du champ avec chaque objectif est la suivante: 4x = 3400, 10x = 1333, 40x = 340 et 100x = 133 microns. L'équipement et les filtres utilisés ont été décrits dans un article précédent. Quelques photos ont été amalgamés à partir de plusieurs plans de mise au point avec Combine Z ou Hélicon Plus. Toutes les images ont été traitées dans PhotoPaint et Neat Image.

 

 
 

L'éosine est une aniline acide, qui est considérée pour avoir une affinité sélective pour le cytoplasme cellulaire. Au contraire on considère l' hématoxyline comme un colorant basique, qui par conséquent a une affinité avec les éléments acides cellulaires. Comme les noyaux sont formés fondamentalement par des Acides Ribonucléiques, on utilise l'hématoxyline pour les colorer.

 

 
 

Celle-ci est le colorant de base universellement utilisée dans la technique de coloration à Hématoxyline-Éosine, qui fournit des noyaux teints en bleu, ( ou presque noir, selon la formule employée) et cytoplasmes rougeâtres.

 

 

Glandes de Paneth, dans le fond d'une Crypte de Lieberkhün, coupe de duodénum humain. Fixation en Formol Neutre, inclusion en Paraffine, coupes au microtome à 6 microns d'épaisseur, coloration a l'Hematoxyline de Harris -Éosine. Objectif planachromatique 40x. Eclairage critique, lumière halogène avec filtre au dydinium.

 

 

L'utilisation d'une solution commerciale à 2% d'éosine, qui m'a été envoyé par Jean-Marie Cavanihac a montré que dans l'épiderme d'Aptenia cordifolia l'éosine colorait fortement les noyaux (et les nucléoles) ainsi que les chloroplastes, et beaucoup plus faiblement ou pas du tout le cytoplasme

 

 

Stomate de l'épiderme d'Aptenia cordifolia, frais, sans coloration, monté en glycérine 30%. Obj. X 100. Deux images combinées avec CombineZ 5

 

Stomate de l'épiderme d'Aptenia cordifolia, fixée avec AFA, coloré à l'éosine 1%, monté dans la glycérine avec concentration préliminaire. Obj. x 100. Quatre images combinées avec CombineZ 5.

 

 

Je n'ai jamais vu de source concernant l'utilisation de l'éosine comme colorant nucléaire, et une recherche très étendue sur le WWW n'a fourni aucune référence en ce sens, renforçant largement par contre l'idée de l'utilisation de l'éosine simplement comme colorant de fond.

En concertation avec J.M. Cavanihac qui a exprimé des doutes sur l'existence de quelque additif dans la solution commerciale et qui pourrait être responsable d'un tel comportement que l'on pourrait considérer comme "anormal", et il a suggéré le démontrer avec des solutions préparées directement dans le laboratoire.

 

 

Cellules de l'épiderme d'Aptenia. Fixées dans l'AFA, colorées à l'éosine 1%, montées dans la glycérine, après concentration. Obj. x 100

 

Nucléus de cellule lacunaire, épiderme du dessus de la feuille d'Aptenia. Fixée avec AFA, colorée à l'éosine 1%, montée à la glycérine après concentration. Obj. x 100



 

Par conséquent en utilisant de l'éosine en poudre, achetée dans une vielle pharmacie à Durango, j'ai préparé deux solutions d'éosine :

1) dans un mélange éthylméthylique (MEM,( alcool éthylique 96%....70ml ; alcool méthylique 85%)....30 ml)

2) dans l'eau distillée.

et aussi

3) j'ai aussi utilisé la solution commerciale européenne.

 

 

Rhoeo spatifolia, stomate. Épiderme frais, monté a la glycérine 30%. Obj. x 40

 

 

Stomate, Rhoeo, épiderme fixé avec FAA, coloré avec éosine 1%, monté à la glycérine 50%. Obj. 100x Trois images « procesées » avec Combine Z5.

 

 

La solution alcoolique s'est avérée difficile à fabriquer. L'alcool a dissous peu de colorant et la solution a été apparemment une solution saturée. La couleur a été claire, transparente et jaunâtre.

 

L'eau a facilement dissous une plus grande quantité d'éosine. La solution diluée a montré la même couleur que la solution alcoolique, mais, au fur et à mesure qu'elle se concentrait, elle devenait rouge comme la solution commerciale.

 

 

08-esosine
09-eosine

Cellules d'une cataphille d'oignon. Fixés dans D1B, un nouveau fixateur avec ZnCl2, La fixation montre les trabées cytoplasmiques du protoplasme pariétal. Colorées à l'éosine 1%, montées dans la glycérine 50%, Obj. 40x

Le nucléus d'une cellule de la préparation précédente, montrant les 3 nucléoles. Même traitement que dans la fig. 08. Obj. 100x . Deux MAP combinés dans Hélicon Plus

 

 

1- Épidermes végétaux.

Trois portions d'épiderme de Aptenia cordifolia ont été fixées en AFA, (Alcool, Formol, Acide acétique) pendant une heure. Ils ont été lavés dans deux eaux différentes, et on a immergé l'une d'entre elles dans chaque solution colorante pendant 5-6 minutes.

Les épidermes ont été ensuite lavés soigneusement dans deux eaux, jusqu'à ce qu'ils n'aient plu perdu de colorant et ils ont été ensuite montés entre lame et lamelle dans la glycérine à 50%.

Les préparations ont été manuellement comprimées sous une couche de papier absorbant pour obtenir des préparations bien minces et lisibles. Elles ont étés scelles au vernis à ongles pour améliorer la conservation.

 

 

 

Stamen de Tradescantia virginica. Fixé dans l'AFA, coloré à l'éosine 1%. Monté en glycérine 30%. A gauche on voit les vaisseaux centraux, les nucléus colorés des cellules, et quelque "filaments staminaux". Ces filaments sont excellents pour montrer dans le vivant le mouvement du cytoplasme pariétal. Obj. x 10. Un filtre W-Rh (Rheinberg avec quadrants rouges et bleus)

 

Epiderme du stamen avec l'objectif x 40, le traitement a été expliqué dans l'image précédente.

 

 

Résultats :

1) Éosine Européenne commerciale: comme dans l'essai préliminaire les noyaux et nucléoles, ainsi que les chloroplastes étaient bien colorés, pas les cytoplasmes.

2) Éosine en eau: Le résultat est totalement semblable à celui de la solution commerciale.

3) Éosine en alcool: en dépit de sa couleur beaucoup plus claire et jaunâtre et de la faible concentration d'éosine dissoute, le résultat a été très semblable aux deux cass précédents. Peut-être les découpes des noyaux sont un peu plus nettes que dans les deux autres solutions. Évidement si le matériel supporte un traitement par l'alcool cette technique économise beaucoup d'éosine.

 

 

Une cellule d'un poil staminal de la fleur de Rhoeo spathifolia. Fixée dans D1b, colorée à l'éosine à 1%, montée dans la glycérine à 30%. Obj. x 100. On a pris 3 plans de mise au point puis combinés avec Hélicon Focus. Le nucléus était suspendu au milieu de la cellule, et il est donné à la photo par le plan médian.

 

 

2- Épithélium gingival

Les cellules obtenues en éraflant l'intérieur de la joue furent montés en solution physiologique diluée 50/50 avec de l'éosine aqueuse 1%.

Résultats.- L'examen a montré que les cellules se coloraient convenablement et que en quelques secondes le noyau et ses nucléoles étaient rapidement différenciés.

On a parallèlement effectué une coloration avec du bleu de méthylène (la solution pour aquariophiles) qui a coloré les noyaux et accessoirement des bactéries à l'extérieur des cellules, mais l'aspect n'est pas si net et propre qu'avec l'éosine.

 

 
13-eosine
14-eosine
Cellules de la joue, dans la solution physiologique, sans colorant, fond clair, objectif x 100

Cellules de la joue montées à l'eau après coloration au bleu de méthylène à 1%. Fond clair, x 100

15-eosine
16-eosine

Deux images de cellules de la joue colorées avec l'éosine aqueuse à 0.1%. Celles à gauche ont été montées dans une solution concentrée de borax (borate de sodium), à droite une cellule dans l'eau, quatre images traitées par Combine Z5, le fond a été substitué sous PhotoPaint. Objectif x 100.

 


La coloration avec l'éosine, et ensuite avec le bleu comme contraste, ne s'est pas avéré adéquate. Le bleu a été fixé partiellement dans le cytoplasme. L'éosine a dominé la coloration et n'a pas été déplacée par le bleu.

3- Rotiféres

Une population de Adineta sp. a été fixée par la chaleur. Une fois le liquide refroidi, on a ajouté l'éosine à 2%, goutte à goutte jusqu'à obtenir dans le liquide une coloration rouge, faible, mais définie. Une petite goutte du dépôt a été mélangée avec une goutte équivalente de glycérine à 50%, et couvert avec un lamelle de manière à obtenir une préparation très fine.

 

 

Une espèce d'Adineta, fixée par l'eau à 60ºC, colorée à l'éosine a 0.5%, montée à la glycérine à 25%. Obj. x40. Le détritus n'a pas pris le colorant, mais les animaux ont été fortement colorés.

 

 

18-eosine
19-eosine

Deux exemples de rotifères colores au carmin, et montés dans la glycérine. Images prises de la base de donnés nnnnnnn pour comparer avec mes résultats a l'éosine.

Un exemplaire d'Adineta fixé par la chaleur, coloré à l'éosine et monté à la glycérine, Image supérieure en fond clair, image inférieure avec éclairage oblique

 

 

4- Nématodes

 

Des nématodes Physaloptera squamata parasites du lézard des murs très commun à Cancún ont été fixés par l'alcool à 50% chauffé à 60ºC, et placés dans une solution d'éosine à 0.5% pendant 5 minutes. Les nématodes ont pris une forte coloration. On les a passés ensuite à la glycérine à 15% et ils ont été montés après 20 minutes à la glycérine à 30%.

 

 
20-eosina

Une portion d'un mâle de Physaloptera, fixé dans l'alcool 70%, coloré à l'éosine et monté à la glycérine. Photographié avec un filtre W-Rh bleu-rouge. Pour mieux découper l'image on a remplacé le fond (bleu foncé) pour un fond noir. En bas on voit l'intestin du ver, et au dessus les testicules, et la vésicule séminale.

 

 

 

 

Les filtres de contraste sont utilisables également avec le matériel frais bien qu'ils donnent d'autres effets de couleur et qu'ils fournissent des possibilités additionnelles intéressantes en éclairage oblique.

 

En accord avec cette expérience les points importants seraient :

1) utiliser un fixateur aqueux, l'alcool 70 a déformé un peu les animaux 
2) laver à l' eau et passer à l'éosine très diluée (probablement un 0.1 ou 0.2% serait suffisant)
3) surveiller la coloration, en transférant souvent dans l'eau propre et l'arrêter en lavant dans l'acide acétique à 0.5% (vinaigre)
4) Éliminer l'acétique par lavage en eau pure
5) passer à la glycérine à 10% et laisser concentrer jusqu'approx. 50% 
6) Monter à la Glycérine, glycérine Gélatinée ou PVA-G.

Si on utilise une solution colorante plus concentrée et on surcolore, il est possible de régresser la coloration en décolorant avec l'acide chlorhydrique à 0.1%.
Surveiller au 40x le processus de décoloration puisqu'il prend seulement quelques minutes. L'arrêter par lavage abondant à l' eau. Continuer le montage comme plus haut.

 

 

22-eosine

Objectif 40x. Les glandes et, entre la deuxième et la troisième, les spicules génitales. Même traitement pour ces deux images que dans l'image au dessous. Fond clair.

 

 

Extrémité caudale d'un mâle de Physaloptera. On voit par transparence les allules caudales qui servent pour etreindre la femelle, et les quatre longues glandes génitales situés sur chaque allule. Objective 10x. Fond clair. On a remplacé le fond avec PhotoPaint.

 

 

 

Conclusions:

Dans le cas des épidermes végétaux, la coloration a offert un important avantage par rapport à l'examen de produits frais, sans coloration. Les noyaux, nucléoles, chloroplastes et cytoplasmes sont mieux différenciés. L'aspect est aussi plus attrayant et si les matériels sont préalablement fixés (avec AFA ou GALA) et si on traite les lames par des méthodes adéquates elles peuvent être transformées en préparations permanentes.

La coloration et le montage dans la glycérine des rotifères a donné de meilleurs résultats que ceux que nous obtenions préalablement en montant des individus sans les colorer. Mais l'observation sur le vivant est toujours meilleure, bien que plus difficile, qu'avec dans les animaux fixés .

Avec les nématodes montés dans la glycérine, au préalable clarifiés, quelques tissus se distinguent par une plus grande absorption du colorant ou une différence dans le rendu des couleurs, les organes sont ainsi clairement différenciés.

Les disques de contraste, surtout les Rheinberg, ont permis d'améliorer encore plus l'étude topographique en offrant des possibilités de couleur et d'éclairage oblique très intéressantes.

Avec Physaloptera, l'analyse de la structure des ailes caudales, le système nerveux et l'appareil excréteur, a été beaucoup mieux faite avec la coloration, que sur l'individu étudié au in vivo, sans colorant. Egalement on voit mieux quelques structures glandulaires.

Toutefois dans ce cas une préparation sans coloration, mais montée à la glycérine par la méthode traditionnelle a aussi donné une bonne définition de l'organographie.
Elle permet une utilisation intelligente des disques de contraste.
Suivie par un traitement d'image elle peut offrir dans quelques cas et pour quelques détails, des meilleurs résultats que la coloration.

Les essais précédents indiquent qu'ils peuvent être fructueux pour trouver de nouveaux groupes d'invertébrés (Temnocephalida, Digenea, Monogenea, Cestodaria, Turbellaria, Micro-oligochaetes, etc.) puisque l'éosine est un colorant économique, facile à obtenir, et dont les techniques d'utilisation sont très faciles.

CONSERVATION

Quatre mois après les essais, la coloration s'est maintenue avec la même intensité et encore meilleure définition qu'au début.

 

 

 

 

Vous pouvez retrouver l'Auteur de cet article au sein du groupe :

© MicrOscOpieS.com MicrOscOpieS.org Mikroscopia.com et les Auteurs.


Toute reproduction même partielle du site MicrOscOpieS.com ou des Articles du Magazine MicrOscOpieS est interdite sans l'accord du Propriétaire ou des Auteurs

© Tous droits réservés. MicrOscOpieS.com , MicrOscOpieS.org & Mikroscopia.com