A propos de Microscopes, d’instruments et de mesures.

(Avec un soupçon d’électronique au passage)

Durango (Dgo) Mexique

 

 

 

 

Voici la traduction de mon article paru dans Micscape en avril 2002, elle est suivie d'une mise-à-jour de juin 2003.

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Il apparaît dans plusieurs articles du magazine Micscape que beaucoup d’amateurs doivent ou souhaitent pouvoir mesurer les objets microscopiques qu’ils manipulent.

 

Et, puisque personne n’est au même niveau d’amateurisme, il faut à chacun la méthode appropriée à son cas .C’est aujourd’hui possible, car il existe plusieurs méthodes et techniques pour cela.

 

1)Pour ceux qui possèdent un appareil photo ou une caméra connectée sur ordinateur et monté sur le microscope, il est possible d’utiliser la méthode toute simple de mesure directe par le biais d’une règle affichée sur l’écran du moniteur, ainsi que le propose Jean-Marie Cavanihac dans son article pour novices paru dans Micscape en mai 2000 : « introduction à la microscopie quantitative ».

Vous trouverez aussi dans les notes de l’éditeur que Dave Walker propose à la place de l’épaisseur d’une lame couvre-objet un réticule d’oculaire comme référence standard.

 

2) Dans leur livre, ancien mais toujours d’actualité, sur les protozoaires (1949), T.L et F.F JAHN proposent une méthode approximative qui ne vous demandera rien d’autre que votre microscope et vos yeux : utiliser un morceau de papier millimétré, et estimer visuellement (avec la plus grande attention) le diamètre du champ visible.

Voici une reproduction  (par scanner) de leur illustration n°4 : le champ de leur objectif X10 a un diamètre d’environ 1600µm.

 

 
 
 
 

 

En vous servant de cette méthode sur un objectif faible, vous pouvez estimer le champ de votre objectif le plus puissant à l’aide d’une simple « règle de trois ». Si votre objectif est un X43 (par exemple), ils proposent ce calcul : 1600/ (43/10) = 372. (Ceci est valable pour tout autre objectif).

Avec cette méthode, ils pensent qu’il est possible d’estimer sans trop d’écart les dimensions d’un objet qui fait 1/5 ème du champ (c’est à dire 250-300µm pour le X10, et 70-80µm pour le X43).

 

3) Il n’y a pas si longtemps, la seule méthode valable et reconnue de faire des mesures d’objets microscopiques passait par la combinaison d’un micromètre oculaire et d’une règle-objet. Le micromètre oculaire est un disque de verre sur lequel est gravé une échelle comprenant généralement 100 divisions, de valeur arbitraire. Au contraire, les dimensions de la règle –objet doivent être connues avec une grande précision. En fait, c’est une échelle de 1 ou 2 millimètres de long, dont chaque millimètre est divisé en 100 parties. Chaque division représente donc 10µm. (Vous pouvez vous imaginer ce qu’il y avait d’héroïque dans la fabrication d’un tel objet aux premiers temps de la microscopie !)

 

Vous mettez cette règle-étalon sur la platine, sous l’objectif. Avec l’oculaire micrométrique, vous faites la mise au point et superposez les deux échelles. Vous notez alors combien de divisions  coïncident parfaitement avec celles du micromètre oculaire. Vous pouvez ainsi calculer combien une division de ce dernier représente, et mesurer tout objet placé dans le champ. Cette méthode est optimale pour des objets immobiles, comme les coupes histologiques, les montages définitifs, etc.. Jusqu’à présent, c’était la méthode des professionnels.

 

D’un autre côté, si cette méthode n’est pas affinée à l’aide de quelques statistiques, elle ne donne qu’une idée juste des dimensions de l’objet. Si l’on recommence les mesures, on ne trouve pas les mêmes résultats (hormis des objets aux contours bien définis et des points de repère remarquables). Les différences sont infimes, mais elles sont là !

Si vous voulez être précis, vous devez calculer des moyennes et des écarts (votre calculatrice de poche ou celle de Windows viendra à votre aide)

Cette méthode professionnelle donne normalement une marge d’erreur inférieure à 1%.

 

Toutes les autres méthodes peuvent être soumises à cet affinage, bien sûr. Cela ne les rendra pas plus précises, mais permettra de définir leur taux de précision, ce qui est aussi important, sinon plus.

 

4) Les JAHN ont adapté cette méthode à la bourse d’un étudiant ou d’un amateur, en laissant de côté la règle-objet, et en la remplaçant par du papier millimétré, afin d’obtenir une estimation approximative de la largeur de champ et son équivalence oculaire. Ils sont partis du principe que vous pouviez trouver un oculaire avec une échelle couvrant toute la largeur du champ, et divisé en 100 parties. Si votre champ mesure environ 1600µm, chaque division correspondra à 16µm. S’il fait 372 µm, une division vaudra 3.72 µm, etc.

Mais faire des mesures correctes est un vrai problème si vous ne disposez pas de ce type particulier de micromètre oculaire.

Chitchai Chantangsi une élégante méthode, adaptée à nos nouveaux appareils photos, non obligatoirement digitaux, mais aidés par informatique et scanner, et à mettre en œuvre sur le bureau, avec une image imprimée. Pas besoin de résumer cette façon de faire, elle est toute neuve.

 

5) Celui qui lit le magazine de Micscape est en possession d’un ordinateur, forcément !

La plupart de ceux-là possèdent un microscope, et beaucoup d’entre eux ont essayé, ou espèrent le faire, une webcam ou un appareil photo numérique pour faire de la photo d’objets microscopiques. Avec cette idée en tête, j’ai essayé dans le reste de cet article de leur mettre entre les mains une autre méthode, et d’en présenter les bases.

 

Ainsi qu’il est écrit plus haut, la meilleure et plus professionnelle des méthodes nécessite une lame étalon et un micromètre oculaire.

Comme j’ai cette lame, mais pas le micromètre, ce qui est l’inverse de ce que proposent les Jahn, voici mon approche.

 

Avant tout, j’ai mesuré avec précision le champ de chacun de mes objectifs (ma confiance envers les données du constructeur étant limitée, je recherchais les erreurs). A ma grande surprise mes chiffres, à peine arrondis, confirmaient ceux gravés sur les boîtiers de chaque objectif. Dans la table 1, vous pouvez vous rendre compte que le X40, par exemple, est exactement dix fois plus puissant que le X4, et 2,5 fois plus que le X10.

 

 
 
 
 

 

Ce début était prometteur. Ensuite, j’ai mis mon appareil en route, et pris une photo en 640X480 de la règle étalon avec chacun des objectifs. Comme celle-ci est montée verticalement sur la platine (ndt : dans l’alignement de la potence), je ne pouvais obtenir que la plus petite des dimensions du champ photographique, ce qui était tout de même suffisant.

Mais par amour de la finition, j’ai calculé des autres dimensions : table 2 et illustrations 3 à 6.

 

 
 
 
 
 
 
 
 

 

La qualité de la photo prise au X4 est décevante. Cette qualité dépend de la résolution de la caméra, qui est de 640X480 à 72 DPI. Images destinées à Internet !

 

Ce format de 640X480, utilisé comme standard de prises de vue est automatiquement créé par le programme de capture, qui extrapole les pixels nécessaires. Tout comme en microscopie lorsque vous utilisez un oculaire trop fort, l’ »agrandissement » est « vide » : il n’y a pas plus de détails, seulement une amélioration de la vue ! Puisque l’objectif X4 plan achromatique a une ON de 0.10, sa résolution théorique en lumière verte est 2,75 µm (un bon récapitulatif sur les objectifs se trouve sur le site de Molecular Expressions). Vues au travers de l’oculaire, les lignes de l’échelle sont clairement distantes de 10 microns, mais….

 

Un pixel est une entité « tout ou rien » ; il ne contient aucune information supplémentaire, juste une ombre qui dépend de la profondeur de couleur, ou de l’échelle des gris définie sur votre système. Ainsi, sur une ligne  de 320 pixels, il y a 320 points qui peuvent être activés. L’image provenant du microscope qui doit être enregistrée sur ces 320 pixels fait 3400 µm (voir table 2)

Ainsi, chaque pixel représente 10,6µm, et ceci est la limite de résolution de mon pauvre appareil photo (webcam), de par sa construction même ! Donc, cette limite est 3,9 fois plus grande que celle de l’objectif. Et donc, il n’est pas possible d’utiliser directement cette échelle X4 imprimée. (si vous voulez pouvoir vous servir de cette échelle X4, il est clair qu’il vous faut une webcam, ou un appareil photo numérique dont la résolution soit 4 fois supérieure à celle-ci !) Si votre appareil numérique (sans objectif) se comporte de la même manière qu’un argentique, vous pourriez allonger le tube de façon à ce que l’image sur le capteur soit réduite : le champ réduit à 960µm entraîne une relation microns/pixels telle que chaque pixel correspond à 3µm (960/320). Vos divisions de 10µm pourront alors coïncider parfaitement bien avec 10µm en recouvrant 3 pixels. Mais la photographie classique entraîne des temps de pose qu’il faut surveiller de près, et vous ne pouvez voir dans l’oculaire qu’une petite partie du champ. Pour obtenir sur la photo la même chose que ce que voit votre œil, il faut recourir à la technique de la « mosaïque » (décrite dans micscape par Jean-Marie Cavanihac), on n’a rien sans rien !

 

Mais revenons à mon appareil numérique. Je peux faire des clichés plus ou moins bons de l’échelle étalon en utilisant les autres objectifs (X10, X40, X100..), mais à chaque fois, bien sûr, la résolution sera 4 fois inférieure  à l’observation directe.

 

Pour imprimer ces échelles, je vous recommande un format 640X480 pixels

Pour calculer la taille de la version imprimée :

 

640 pixels/72 pixels (résolution appareil et résolution écran)=8,8 pouces (22,58 cm)

480 donnent : 6,67 pouces (16,93 cm)

Quelle que soit le nombre de dpi utilisés par l’imprimante, c’est un document de cette taille qui sera imprimé. Monter ou descendre le nombre de DPI sur l’imprimante ne joue que sur la qualité de l’impression. Le document par lui-même ne subit aucune modification.

 

Avec l’objectif X10, 16,93 cm= 1000 µm (voir table 2). Il est alors facile de convertir un mm en son équivalent en microns : 1000/169,3 =  5,91 (on va dire 5,9)

 

Je prends une photo de ce que je veux avec le X10, en 640X480, je l’imprime, et avec ma bonne vieille règle métallique, je relève les mesures que je veux. Une simple multiplication des mm par 5,9 me donne la taille en microns. Je vous laisse calculer les équivalents pour les autres objectifs.

Astuce : pour l’objectif X4, je me sers de la relation déjà vue entre les puissances (voir les deux tables) et j’obtiens l’équivalent du X4 en divisant l’équivalent du X40 par 10.

 

Avec cette méthode, vous avez réellement l’opportunité de faire des mesures relativement précises avec votre matériel. Pendant longtemps, cette méthode a été en usage, le « tube à dessin » remplaçait l’appareil photo. Les clichés des appareils numériques (même mauvais) sont de bien meilleure qualité qu’un simple dessin pour faire des mesures : voir l’article de Roy Winsby sur l’utilisation du « tube à dessin »

 

 

6) Pour réaliser cette expérience, il vous faut, en plus du microscope, une webcam, une imprimante et une règle micrométrique. Vous êtes sûrement en possession des trois premiers. Pour l’échelle étalon, si vous êtes amateur et que vous ne vouliez pas en acheter une, du moins pour le moment, souvenez-vous de ce que faisaient les Jahn, et utilisez du papier millimétré, ou bien une règle finement gravée. Ou bien encore mieux, une bonne règle d’architecte éclairée par le dessus (voir D.Walker pour l’éclairage), certaines sont graduées en 0.5 mm).

Si vous êtes assez riche pour posséder un oculaire réticulé gradué en unités connues (il y en a qui font exactement 1cm, subdivisé en 0.1 ou 0.2 mm), vous pouvez vous en servir à la place de l’échelle micrométrique.

Est-ce que vous vous rendez compte de l’avantage que vous avez sur les Jahn ?

Vous imprimez votre image et prenez tranquillement vos mesures sur votre bureau, et y représenter le champ réel de votre caméra, ce qui est tout de même plus confortable que d’avoir l’œil rivé sur l’oculaire. C’est presque comme si vous disposiez d’un oculaire micrométrique. 52 ans se sont écoulés depuis le livre des Jahn, 52 ans qui font la différence !

 

Voici le résultat de mes propres essais : L’échelle millimétrique imprimée peut faire plus ou moins de 169mm. J’ai essayé plusieurs valeurs, entre 168 et 172, la plupart dans les 170 mm (voir l’image ci dessus, cliquez et imprimez-là) Comparez avec les 169,3 mm auquel nous savons que correspond un mm. Et calculez l’équivalent : 1000 (microns/mm)/170 = 5,88

N’est-ce pas là un résultat étonnant ? , et obtenu sans échelle-étalon coûteuse !

 

Appréciez-vous le fait que vous puissiez maintenant faire vos mesures comme un pro ?

 

Si vous désirez aussi ajouter une échelle de référence, il vous faut passer par un processeur d’image électronique, comme Chantangsi le suggère. J’ai utilisé une autre méthode, avec les mêmes résultats, mais c’est un article très long. Si vous avez le processeur d’image et ses outils, vous pouvez sûrement faire vos propres échelles de référence.

 

Par la même occasion, et ce sera ma dernière remarque, l’augmentation de la puissance des objectifs, avec le même oculaire (X10 dans mon cas) entraîne l’augmentation du grossissement : x400 avec le X40.

Mais la caméra se comporte différemment : voyez la table deux, ou 1000 µm (1mm) de l’image en 480 donne un équivalent de 16,93 cm ou 169,3 mm. Le grossissement visuel est 10X10 = 100, mais la caméra donne  un grossissement de 169,3 fois, 170 erreurs comprises.

Vérifiez !

 

Encore un dernière remarque : Si maintenant vous êtes convaincus par la méthode décrite ci-dessus, et que vous y réfléchissiez un peu, vous vous apercevez que si vous aviez votre propre  photo de la règle (que ce soit l’échelle étalon ou la règle d’architecte), peu importe ou vous effectuez les mesures. Sur l’écran, sur l’imprimante, à pleine image ou sur une image réduite, vous avez toujours la possibilité de mesurer votre « millimètre image »et en déduire le coefficient microns/millimètre, afin de pouvoir mesurer les détails sur la photographie d’un objet microscopique imprimé à la même échelle.

En ce qui me concerne, je préfère le bureau à l’écran, mais peut-être n’avez-vous pas d’imprimante ?

 

Ceux d’entre vous qui ont des caméras digitales ou des appareils photos numériques de plus haute qualité peuvent faire un bien meilleur travail que ce que j’ai pu faire. Envoyez-moi vos résultats, que je puisse les publier pour le plus grand bénéfice de tous les autres. Et n’oubliez pas que « statistiques », « moyennes » et « erreurs standard »sont des mots qui doivent faire partie de notre vocabulaire journalier, le manuel de vos calculettes en parlent sûrement. Après quelques instants de lecture et de méditation sur ce sujet, vous serez un amateur bien mieux informé. Mesurez toujours plusieurs fois le même objet !

 

Tout commentaire par E-mail sera le bienvenu chez l’auteur : Walter Dioni

 

Bibliographie :

 
 
 
 

 

W.D

 



Mise à jour

C'était mon premier article de micrographie amateur pour le Web et les
lecteurs s'en rendront compte, je connaissais assez peu de choses sur les
capteurs numériques. (Je venais à peine de recevoir mon microscope avec sa
chambre intégrée et procédais aux premiers tests)

Il me parait un peu dépassé d'avoir écrit un article si long qui
maintenant pourrait se décliner en beaucoup moins de mots et de façon bien
plus claire.

"

  • Photographiez avec l'objectif 10 X une échelle graduée la plus précise
    possible *
    (en 640 x 480 et une résolution de 72 ppp)

  • Imprimez le résultat en 22.6 cm par 16.9 cm.

  • Mesurez en mm la taille du millimètre imprimé.

    Attention: Prenez bien en considération où commence et où finit
    réellement l'image du millimètre.
    Par exemple commencez à mesurer le bord gauche du trait
    de gauche jusqu'au bord gauche du trait de droite.

  • Divisez 1000 µ (1 mm) par la taille en mm de l'image du millimètre et
    multipliez par la taille du champ imprimé en mm.
    Vous obtiendrez la LARGEUR du CHAMP de VUE de votre CAPTEUR avec
    l'objectif de 10X exprimé en µ.

  • Divisez maintenant cette valeur par la largeur de l'impression en mm
    (probablement 226 mm) et vous obtiendrez un Indice en µ.

  • Prenez une photographie du sujet que vous désirez qu'il soit vivant,
    anesthésié ou fixé, (toujours en 640 x 480 et 72 ppp)

  • Imprimez la photographie en 640 x 480.

  • Mesurez sur cette dernière l'élément caractéristique que vous souhaitez et
    multipliez par l 'Indice, le résultat sera la mesure désirée, exprimée en
    µ.

  • Appliquez de la même manière cette technique à l'objectif 4 X vous
    n'aurez aucun problème. (Avec les H x V et ppp de votre capteur)

Vous pouvez prétendre à une précision de 2 à 3 % de la valeur que vous
obtiendriez avec un micromètre de platine et un oculaire micrométrique
professionnels.

Pour travailler avec un objectif 40x il est probable que vous devriez
recourir à un" standard secondaire" car la règle graduée ne sera plus visible
à ce grossissement.

  • Photographiez à l'objectif 10 X un objet qui mesure environ 1/5 du champ
    de vue et assignez-lui une valeur en µ.

  • Maintenant prenez une photo au 40 X

  • Continuez la procédure précédente mais utilisez dans le calcul la taille
    de l'objet échelle.

  • Pour l' objectif 100 X si vous en possédez un, vous pouvez utiliser la
    même méthode mais il sera plus confortable de diviser par dix l'Indice
    calculé avec le 10 X.

C'est tout.
Cette méthode pour amateurs ne disposant pas de micromètre bien appliquée
peut avoir la même précision que la méthode professionnelle.

*Il existe des règles d'architecte de très bonne qualité graduées en demi
millimètres

"


-oOo-


Je remercie Christian Colin et son épouse pour la traduction française.

Walter.
 

 

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