TIPS TECHNIQUES SUR L'UTILISATION DE LA

"TRANCHETTE"

À DEUX LAMES DE RASOIR

 

Walter Dioni 
     Cancún (Q.Roo), Mexique
 

 

 



Les photos ont été prises en 640 x 480, et réduites pour leur insertion dans l'article. Quelques photos sont cliquables. La largeur du champ de chaque objectif est la suivante:
4x = 3400, 10x = 1333, 40x = 340 et 100x = 133 microns.
Ces valeurs sont valables pour les photos non découpées ni combinées avec d'autres Le matériel et les filtres utilisés ont été décrits dans un article précèdent. Vous profiterez mieux de cet article avec une résolution de 800 x 600 pix.

 
 

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La veine centrale de la feuille d'une plante grimpante de nom inconnu (de moi) traitée à l'hypochlorite, colorée au Violet de Gentiane...et photographiée avec le disque de contraste COL-D3. Trois photos, composées avec PhotoPaint. Le fond a été aussi ajouté avec PhotoPaint
 


Je présente ici quelques aspects techniques pour aider à comprendre et utiliser la "tranchette" à deux lames de rasoir. Les aspects botaniques (anatomie, histologie, taxonomie) seront mieux traitées dans les articles spéciaux sur quelques espèces qui seront publies a la suite de celui-ci. Pour les lecteurs qui comme moi sont des débutants en botanique je recommande de consulter le très beau site d'Hélène Hubert: L'anatomie des angiospermes pour mieux comprendre la terminologie utilisée:

 
 

 

Sur la nature des séparateurs. J'ai essayé 4 genres de séparateurs. Les étiquettes auto-adhésives en papier, un ruban isolant d’électricien en plastique noir, une marque de bande adhésive en plastique clair et les lames de rasoir elles-mêmes. Pour pouvoir mesurer l'épaisseur des différents séparateurs j’ai collé des échantillons des bandes au bord d'un porte-objet, et je les ai coupé au raz avec une lame de rasoir. Je pris des photos avec les objectifs 10 x et 40 x en utilisant le disque de contraste COL-D3 qui donne une très bonne séparation optique des composants, et j’ai mesuré l'épaisseur avec l'outil de mesure calibré du programme de l'appareil photo de mon microscope. J'ai brisé en deux la lame de rasoir au niveau de sa fente et une moitié a été recoupée en forme de V. Placées debout au-dessus d'une lame de verre elle peut ainsi offrir son bord à la vue des objectifs.

Les résultats sont mitigés, pas au sujet des matériaux eux mêmes, mais au sujet de l'épaisseur des matériaux coupés.

 
ruban adhésif, x 40
lame de rasoir, x 10
étiquette en papier, x 10
isolant d'électricien, x 10
 
Les limites pour l'épaisseur des coupes.- La bande adhésive (y compris le ruban adhésif relativement large) a une épaisseur de 47-48 microns (approximativement 50). L'étiquette de papier adhésif a 135 microns d'épaisseur; la bande de ruban isolant en fait approximativement 200. Et l'épaisseur des lames de rasoir elles-mêmes avoisine les 100 microns.
 
  Je fais une mesure supplémentaire: la hauteur du tranchant (pas son épaisseur! ). Il avoisine les 290 microns de haut. Ainsi le bord pointu est un triangle isocèle avec une base de 100 microns, et une hauteur de 290 microns. Le tranchant est situé au milieu à 50 microns des bords de la lame.
En utilisant la bande adhésive comme séparateur je fais la mesure de l’écartement en mettant la tranchette sous l’objectif 4 x. L’écartement entre les lames est approximativement de 50 microns comme on pouvait le supposer.

Seules quelques rares coupes ont été de moins de 100 µ. Normalement elles ont de 125 à 150 microns, et parfois un peu plus. Je pense que cela est dû au fait que les bords pointus sont en forme de V .

  Au minimum les tranchants sont séparés de 100 microns (50 microns pour chaque lame).Si vous mettez entre deux lames un séparateur de 50 microns l’écartement entre les bords coupants (pas entre les lames) est de 50 +50+50 = 150 mic. Théoriquement cela correspondrait à la coupe la plus mince que vous pourriez obtenir si les lames étaient parallèles . Mais la flexibilité de tous les séparateurs (sauf la lame métallique qui est rigide) permet d'obtenir des coupes plus minces par des pressions programmées.
  J' ai essayé plusieurs méthodes pour rendre les lames plus ou moins parallèles et la fente plus étroite, mais aucun d'entre elles n'a réussi.

Les coupes le plus facilement obtenues et les plus minces l'ont été en utilisant une moitié de lame de rasoir comme séparateur. Et ceci s'est révélé être la manière la plus facile de construire la tranchette. Mais quelques objets, et particulièrement les coupes longitudinales des tiges, s'obtiennent plus facilement si le séparateur est un ruban adhésif.

C’est pourquoi, comme je l'ai annoncé dans la première partie de cet article, j'emploie actuellement ces deux versions de la tranchette.

Les meilleures lames de rasoir. Ce sont les plus rigides. Essayez plusieurs marques déposées si vous pouvez. Les lames flexibles se laissent écarter par la coupe entrante. Ceci se termine par une coupe en forme de coin. Pour étudier l'anatomie d'une tige ceci n'est pas important, mais cela l l’est pour l'enregistrement photographique. Quoi qu'il en soit, même avec les lames flexibles, en faisant 3 ou 4 tentatives, avec différentes pressions et vitesses, vous pourrez obtenir une coupe exploitable.

Matériaux appropriés. Les matériaux hautement lignifiés doivent être découpés en tranchant très lentement et avec une pression ferme. Vous allez éprouver de grandes difficultés en essayant de faire des coupes de tiges de gramineae (actuellement Poaceae) imprégnées de silice, elles sont très dures. Les matériaux très mous tendent à s'effondrer si les lames sont trop fermées. Les meilleurs matériaux sont ceux qui sont moyennement lignifiés.

Généralement la coupe la plus mince est la meilleure. Mais après plusieurs tentatives vous serez convaincu qu'une coupe d'épaisseur moyenne est parfaite dans la plupart des cas. Si la coupen' est pas coincée, sa surface peut être étudiée aux grossissements élevés avec succès, et elle permet une bonne utilisation de certains filtres COL, . Souvent quand la coupe est trop mince, les filtres ObN et les Rh sont sans effet.

 
 
Préservation des matériaux. Si vous vous trouvez loin de votre laboratoire ou si vous voulez conserver quelques matériaux pour de futures études vous pouvez les fixer. Le fixateur recommandé le plus simple pour les matériaux botaniques est l’alcool éthylique de 70%. Naturellement quelques organes, comme les pétales par exemple peuvent se faner, mais leur anatomie peut être préservée. Pour des anthères, les ovaires, les bouts de racine, et n'importe quel organe reproducteur le Methacarn 95% est peut être le meilleure solution Après 1 ou 2 heures dans le Methacarn,le remplacer par l'alcool à 70% pendant 1 heure et conserver les échantillons dans un deuxième bain d'alcool à 70%,Les résultats sont encore meilleurs avec 1-2% de glycérine. N'oubliez pas de mettre sur votre flacon une étiquette avec les renseignements pertinents.

A gauche une tranche (de l'épitelium jusqu'au parenchyme médullaire) d'une coupe transversale d'une tige de basilic. Champ clair, aucune coloration et pas d'hypochlorite. Enregistré avec l'obj. x40 (4 images) Réduit presque au tiers pour son insertion ici.

Colorations amateur.- les colorations professionnelles, comme vous l'avez sûrement constaté dans la littérature font souvent appel à des colorants métachromatiques comme l'O-Toluidine, ou la Safranine, ou bien à des colorations doubles comme le Carmin – Vert Iode ou Vert Méthyle ou similaires, ou bien encore le Phloroglucynol pour les tissus lignifiés. Pour la plupart des amateurs il est difficile de se procurer ces produits, ou bien leur prix est très élevé.

 

 
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  J'ai remarqué qu'un colorant très commun et facile à se procurer est le Violet de Gentiane, un ancien désinfectant contre le "muguet" (candidose) des bébés, et d'autres infections. Ici il est vendu en solution à 1% dans l'eau. Il est très stable; 20 ml sont une quantité suffisante pour toute votre vie, parce qu'il est employé à raison d'une goutte pour 10 millilitres ou plus d'eau. Cette solution de travail est très durable, elle teint le sclérenchyme et les fibres d’un violet foncé, le xylème d'une couleur plus profonde avec une teinte rouge, et le cambium, phloème et les collenchymes d'un léger pourpre. La cuticule de l'épiderme est également fortement colorée. Comme il a déjà été question,, le bleu de méthylène peut également être employé.

 
Coupe transversale de la tige d’une plante grimpante tropicale. Hypochlorite- Violet de Gentiane
Coupe transversale de la feuille de la même plante
Hypochlorite - Violet de Gentiane

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  Disques de Contraste.- Si vous ne pouvez pas obtenir le Violet de Gentiane (également connu sous le nom de Cristal Violet) vous n'aurez pas besoin de renoncer au Technicolor. Vos meilleurs atouts seront les disques de contraste. La « coloration par dispersion » que Ted Clarke a parfaitement décrite pour des disques de contraste en fond noir pour puissances élevées, est transposable par les amateurs qui travaillent à 4 ou 10x.

Le comportement des disques de contraste dépend beaucoup de l'épaisseur et de la nature des matériaux. Vous devez folâtrer en peu avec les vôtres pour essayer le meilleur effet. J'en ai plus de 30 différents. Je ne sais jamais lequel d’entre eux va donner le meilleur résultat avec une coupe donnée. Mais les ObN (obturateurs Fond Noir), quelques filtres de Rheinberg et quelques modifications des filtres de simulation de Nomarsky proposés par Wim van Egmont donnent des images exceptionnelles. Normalement les filtres COL se comportent réellement comme s’ils étaient simplement des filtres spéciaux pour Fond Noir et ne donnent pas les mêmes résultats qui les rendent si précieux avec les préparations très fines aux forts grossissements.

 
Coupe à travers la paroi d’un jeune fruit d’Hibiscus. Les points blancs dans l’endoderme son des petites drusses * d’Oxalate de Calcium. Obj. X 10. Obturateur de Champs Noire

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Coupe longitudinale de la tige d’Aptenia. Des idioblastes chargés de raphides aciculaires, sont teints en rouge. A droite l’épiderme. La bande orange au centre est le xylème du faisceau vasculaire. X10, Avec un disque de contraste  RHQ
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* drusses: amas sphériques d'oxalate de calcium.
 

Les meilleurs Rheinberg sont ceux qui ont le centré bleu (diamètre de 12-15 millimètre) ou noir avec la couronne extérieure dans différentes teintes de jaune ou d'orange. Une modification utile quelquefois est un disque avec un premier anneau clair de 2 millimètres de large, un anneau rouge de 3 millimètres de large, clair de 2 millimètres, bleu de 2 millimètres et un centre noir de 12 millimètres de diamètre. Centré ou quelque peu déplacé, il donne beaucoup de nuances utiles. Un autre Rheinberg remarquable est le Rheinberg avec Quadrants (RhQ). Le centre de ce filtre est noir, et sa couronne est composée de quadrants alternativement rouges et bleus. Confronté à des sujets avec des fibres transversales et longitudinales il colore le unes en rouge et les autres en bleu (avec toutes les situations intermédiaires que vous pouvez imaginer) Les coupes végétales avec de grandes cellules sont idéales pour montrer son efficacité.

Les filtres « Simulateurs de Nomarsky » originaux de Wim van Egmont sont des disques noirs, avec un croissant transparent marginal et un centre bleu ou pourpre circulaire. Ils sont une combinaison de Fond Noir, de Rheinberg et d' éclairage oblique, et donnent leurs meilleurs résultats avec les objets discrets comme les fibres, les spicules, le sable et assimilés, particulièrement s'ils sont d’indices de réfraction élevés.

Je remplace les disques noirs par des colorés (en bleus profonds ou rouges profonds par exemple) et rends les centres d'un diamètre semblables au disque de Fond Noir pour l'objectif utilisé, dans une couleur contrastante. Je laisse inchangé le croissant transparent. Il donne ses meilleures performances avec des coupes relativement épaisses.

Les disques de contraste (Fond Noir, Rheinberg et Simulateurs de Nomarsky) permettent une très fine différentiation optique des différents tissus, dans les coupes minces et moyennes, imitant les coupes colorées, et quelquefois les dépassant nettement. Ils sont vraiment très utiles (pour le 4x et le 10x et avec quelques limitations à partir des objectifs 40x) pour donner de la variété et gaieté aux photographies de coupes. La résolution en souffre en peu avec le 40x.

Un mot d'avertissement
:
les couleurs les plus utiles pour le rendu visuel des coupes sont agressives pour le capteur de mon appareil-photo et donnent des résultats très mauvais comparés à l'image visuelle. Mais ils se comportent très bien en vision directe. Mon COL-D3 avec un fond jaune donne des résultats étranges. Je vois l'image dans des nuances jaunes, mais l'appareil photo les enregistre comme une gamme de différentes teintes bleues. Ainsi, soyez préparé, au cas où votre appareil photo se comporterait de la même manière. Jugeant par des commentaires publiés, la plupart des appareils photo, y compris celles d’un haut prix, rencontrent ce problème.

Quoi qu'il en soit, la différence entre une coupe brillamment colorée et un gris opaque est vraiment exceptionnelle.

 
Raphides aciculaires dans un idioblaste. Aptenia, Fond clair, sans colorants, x 40.
Drusses d’Oxalate de calcium, dans le parenchyme cortical d’Aptenia, x 40, Fond clair.
Coupe transversale de la tige d’Epipremnum, Fond clair, De l’iode fut ajouté pour colorer l’amidon.
 
Coupes non colorées
: Si vous montez vos coupes récemment faites sans n'importe lequel des médiums suivants: la glycérine ou le PVA-G vous pourrez effectuer une étude approfondie et instructive l'anatomie d'un matériel presque vivant. La glycérine et les PVA-G agissent en tant que protecteurs et même la chlorophylle peut se conserver pendant de nombreux jours sans altération. Tous les tissus végétaux sont facilement reconnaissables par leurs traits morphologiques, et leurs arrangements dans les organes étudiés qui sont très caractéristiques. Vous pouvez découvrir les idioblastes avec leurs cristaux sécrétés, voir même le noyau de beaucoup de cellules, et les plastides, comme les huiles et l'amidon, inclus. Si vous ajoutez à la glycérine une mince quantité d'iode, l'amidon sera coloré en bleu et vous pouvez facilement découvrir les zones de production de l'amidon . Tout ceci se perd si vous videz les cellules de leur contenu avec de l'hypochlorite.

Note : n'essayez pas d'ajouter de l'iode aux coupes faites à partir de matériaux récemment exposés à de fortes lumières ; vous risquez d'avoir un spécimen presque tout bleu et illisible. ( tout au moins à Cancún)

Utilisation du four à Micro-ondes : Le montage au glycérol, ou même dans PVA-G peut exercer sur les cellules vivantes une pression osmotique excessive. Les matériaux sensibles, comme les algues, les poils tendres, les cellules d'épithélium, les hyphes des champignons et les fruits, et ainsi de suite, peuvent s'effondrer. Vous pouvez naturellement employer quelques fixateurs et des routines de déshydratation pour un montage plus prolongé en glycérine. Mais une technique rapide et utile est de mettre les matériaux ou les coupes, rassemblés dans une petite boîte de Pétri, ou même les préparations récemment faites, sur le plateau tournant du four à micro-ondes pendant une durée de 12 à 20 secondes à 100% de puissance. Ceci augmente la vitesse d'infiltration des média de montage, évapore l'eau, éliminant les bulles d'air, et en plus les cellules deviennent turgides. Expérimentez les meilleurs temps avec votre propre four. Le mien est un 700w. Vous pouvez faire des calculs à la règle de trois pour votre propre fourneau.


 
Un faisceau vasculaire dans une partie de coupe d'une plante grimpante inconnue, traité par l’hypochlorite, colorée au Violet de Gentiane et montée au PVA-G.
On voit une grosse cuticule dans l’épiderme, deux drusses dans le collenchyme et deux vaisseau dans le parenchyme cortical.

WD

 

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