Une « TRANCHETTE » PRÉCISE ET BON MARCHÉ POUR L'ENSEIGNEMENT DE LA BOTANIQUE

(Et nouvelles aventures dans mon jardin)

                                      WALTER   DIONI                                      Cancún - MEXICO
 

Les photos ont été prises en 640 x 480, et réduites pour leur insertion dans l'article. Quelques photos sont cliquables. La largeur du champ avec chaque objectif est la suivant: 4x = 3400, 10x = 1333, 40x = 340 et 100x = 133 microns. L'équipement, et les filtres utilisés ont été décrit dans un précèdent article .

Il est préférable de voir cet article avec une résolution de 800 x 600 px.

 
01-occinum
Coupe transversale de la tige de Occinum basilicum, obj. x 10 - Rheinberg avec le centre noir et quatre quadrants rouges et bleus alternant à la périphérie (RhQ)
Cliquez sur la photo pour la voir en grand !

 

  Après mon dernier article j’ai recherché sur le Web des lames de rasoir à double tranchant. C'était une surprise pour moi que 10 pages (au moins 200 articles) ont été offertes à ma recherche. Beaucoup de techniciens, dans plusieurs branches de la science, emploient ou veulent employer ces antiquités. Il y a également des collectionneurs qui en ont acheté depuis des dizaines d'années.

La chose la plus intéressante est que vous pouvez acheter les lames....dans l'hémisphère sud... et que quelques fabricants les vendent aussi dans le nord en quantité limitée. Laissant à part Gillette, il y a BIC, Schick, et American Safety Razors, et chacun des quatre a des usines en France, aux EEUU et également au Mexique. Pour ceux qui sont près d'un supermarché Wallmart il y a sur le Réseau un article qui indique qu'ils vendent nos précieuses lames .

Ainsi j'ai parcouru Cancún à la recherche de vieilles lames de rasoir à deux bords, et finalement j'obtiens en abondance des Permasharp faites au Brésil.

Je me suis livré à de nouvelles aventures avec la "tranchette" de Neuburg.  Je préfère "tranchette", à celui de microtome parce que vraiment les coupes ne sont pas assez minces pour justifier un nom plus technique.
(Un grand merci à Michel, qui a suggéré ce nom, je n'aurait pas su nommer en français cette petite machine !-)

Après plusieurs essais je me suis aperçu que l'épaisseur des coupes était imprévisible. Les lames étant flexibles. Mes doigts exercent une pression toujours différente. Et ainsi de suite.

Par conséquent les succès sont moins nombreux que les échecs.

Ainsi j'ai fini par faire 3 ajouts et 1 modification principale (avec une option additionnelle) au petit instrument.

1) J'ai préparé des surfaces de découpage, en taillant des bandes de 10 cm X 1.5 cm dans des plateaux en polystyrène (expansé) de 3mm d'épaisseur que mon épouse apporte du supermarché.

2) J'ai acheté une pince à relier (Binder Clip) de 32 millimètres de large (40 millimètres seraient préférables) (voir la fig. 1)

3) J'ai acquis un plateau de 9 x 20 x 2.5 cm ( provenant également du supermarché) à remplir avec de l'eau (Bac à dissection)

4) Dans mes précédentes tentatives j'ai utilisé un ruban plastique adhésif pour séparer les lames. La bande a une épaisseur voisine de 50 microns. J'en ai mis un, le long de chacun des côtés (latéraux) d'une des lames de rasoir.

5) Pour les raisons que j'explique dans la deuxième partie de cet article j'emploie maintenant, comme alternative, la moitié d' une des lame de rasoir pour cette fonction. L'épaisseur des lames est presque de 100 microns. J'ai mis une demi lame de rasoir le long du bord supérieur de la tranchette, sans utiliser de bande plastique du tout.
Voyez les détails techniques
.

 
02-materiels
 
Quand je dois faire une coupe, je remonte les lames et les serre avec les mâchoires de la pince à relier juste au-dessus des fentes, ainsi elles sont bien rigides et peuvent être manipulées avec sécurité. Je trempe le tranchant dans l'eau, ou bien je mets quelques gouttes d'eau sur une des lames avant de fermer la tranchette. L'eau monte par capillarité entre les lames.

Je dispose à présent le matériel biologique sur la bande de découpage, et je le maintiens serré avec mon doigt, je prends l’ensemble dans ma main gauche et immerge le tout dans l'eau du bac à dissection.

Avec l'autre main je place la partie coupante des lames en position au-dessus du matériel. En appuyant l'instrument et poussant en avant avec une trajectoire oblique, je coupe lentement jusqu'à ce que les deux bords "dentellent" la surface de découpage. C'est important parce que ça prouve que la coupe est complètement séparée du matériel à couper.


 
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Une bande plastique de 10 centimètres peut supporter des douzaines de tentatives.

Maintenant, c'est mieux d'opérer sous l'eau, j'enlève la pince à relier manuellement ou en m'aidant avec la pointe d'une aiguille ou d'un scalpel, et je sépare les lames de rasoir.

Normalement il y a une belle coupe collée près du bord du tranchant d'une des deux lames. Avec un pinceau fin et souple, je transfère la coupe dans une capsule de deux centimètres de profondeur contenant quelques millilitres de glycérine de 50%.

Remontez le dispositif sandwich à lames de rasoir et serrez-les avec la pince à relier.

 
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Trois coupes d'Epipremnum.
Moyenne épaisseur 10 x,
Cliquez pour agrandir !
Une coupe épaisse, x 4 champ clair
Coupe faite avec un rasoir émoussé. x10, champ clair
 
En quelques minutes on peut faire plusieurs coupes successives, en obtenant des résultats uniformes. Utilisés sur la surface de polystyrène les tranchants des lames gardent pendant de nombreuses heures (même de nomreux jours) leur caractère aiguisé. Vous avez besoin naturellement d'essayer la position appropriée des mâchoires de la pince à relier au-dessus (ou dessous) des fentes du rasoir. Mieux que tout autre dispositif, c'est ce réglage qui définit l'épaisseur de la coupe.

Essayez de mettre les mâchoires juste au dessus (mais pas plus de 4 millimètres) de la limite supérieure des fentes des lames. Dans mon expérience, dans cette limite, les mâchoires placées plus haut donnent des coupes plus minces. Est-il étonnant n'est-il pas ?

Les coupes les plus courantes sont les transversales (les coupes, les x-sections) mais avec cette nouvelle configuration vous pouvez faire aussi des coupes longitudinales. Employez une tige végétale raisonnablement large de 5-6 millimètres de long. Prenez-la entre vos doigts et glissez la tranchette soigneusement entre eux pour atteindre la surface de la tige. Faites la coupe ( de préférence avec des lames neuves) en prenant soin d'étre bien à la verticale (d'aplomb). Non toutes les tentatives ne vont pas réussir. Je fais normalement 3 à 5 coupes pour choisir finalement une coupe mince, transparente et uniforme, avec l’orientation désirée.

 
07-longit.
Coupe verticale de la tige d' Epipremnum . Champ clair, x 10. Cinq photos assemblées avec PhotoPaint
Cliquez sur la photo pour la voir en grand !
 


Vous pouvez monter vos coupes temporairement dans l'eau, ou dans glycérol de 50% dans l'eau. Ce dernier a un très bon indice de réfraction et dure plusieurs heures avec un remplissage minimum. Vous pouvez même employer un peu de VASELINE sur les bords de la lamelle comme il est de coutume de faire dans des montages humides.

Vous savez que votre coupe est assez fine quand le couvre-objet s'étend à plat au-dessus d'elle, ne s’inclinant pas ni n'exigeant pas beaucoup de gouttes de medium.

Quelques fois je travaille sur des petites séries de coupes.

La capsule contenant les coupes recueillies après une séance de travail est mise sur le plateau tournant de mon four à micro-ondes et traitée pendant 12 à 15 secondes d'exposition à 100%. Je les monte à la glycérine pure ou dans PVA-G, et je les mets à part pendant au moins 12 heures avant de les amener au microscope.

Une autre alternative consiste à rassembler les coupes dans l'eau, et de les passer dans une solution d'hypochlorite (chlore libre de 6 %) si j'ai l'intention de faire une préparation plus durable. 

 
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Coupe transversale de la tiege d'Epipremnum . Hypochlorite, Violet de gentiane, Champ clair, obj. x 10.  PVA-G
Coupe d'un pétiole de Syngonium podophyllum, Montée à la glycérine 50%, champ noir,
obj x 10

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Epipremnum Coupe transversale traversant la veine centrale de la feuille. Champ Clair. x 4. Le fond fut traité avec PhotoPaint.
Moisissures sur l'épiderme d'un coupe transversale de feuille de Gerbera, Trois nievaux combinés dans CombineZ, obj x 40. Champ clair. Détail de la photo originale.
 
Des préparations permanentes pourraient être faites avec du sirop de fructose de 70%-80%, le GAF, le PVA-G, à l'exclusion de tout autre traitement, mais avec une progression dans les concentrations des milieux de montage .Vous pouvez aussi faire une imprégnation de glycérine, si vous voulez monter dans la gelée de glycérine. J'ai même monté directement dans PVA-G. Ces préparations sont bonnes pour une vue générale de l'histologie des organes étudiés.

Avec n’importe laquelle des deux procédures vous pouvez aussi profiter de l'assortiment de disques de contraste * qui vous donnent l'avantage de la « coloration par diffraction » sans compter les possibilités de l'éclairage normal.

Après la séquence photographique, ou de dessin, les coupes peuvent être récupérées, lavées en eau distillée, et être aussi soumises à une technique plus classique et plus permanente de montage

Le traitement classique exige de se débarrasser des cytoplasmes avec de l'hypochlorite et faire ensuite une coloration différentielle des membranes des cellules avec un ou plusieurs colorants.

Pour la construction et l'usage des disques de contraste voir: Dioni
http://www.microscopy-uk.org.uk/mag/artdec03/wdonion2.html

Pour apprendre à faire des préparations selon le modèle classique voir ces références
http://www2.ac-lyon.fr/enseigne/biologie/ress/biologie_vegetale/cou_veg.html
http://www.ualr.edu/~botany/celltiss_lab.html
http://www.zoo.utoronto.ca/able/volumes/vol-19/09-yeung/09-yeung.htm

Vous pouvez trouver une présentation magnifique d'images d'histologie végétale faites selon des méthodes professionnelles dans
http://www.mhhe.com/biosci/pae/botany/histology/html/ptmodov.htm

Un très bon article technique qui traite de l'art de faire des préparations permanentes de coupes végétales est présenté par Jim Battersby dans les numéros de février et mars 2004 de Micscape Magazine

Dans un autre article je traite en détail des techniques de conception de la tranchette avec de nombreuses illustrations sur ses performances.

 

 
12- hybiscus
Coupe épaisse (pour conserver les graines à l'interieur) d'un ovaire mature d'hybiscus rosa-sinensis. C'est une mosaïque de dix photos différentes assembles avec PhotoPaint
 

 

LES AVANTAGES

1) Pas besoin d'appui pour les tissus. (Moelle de sureau, polystyrène, carotte, pomme de terre, paraffine) ce qui est par un grand avantage. Pensez à ceci parce que c'est une caractéristique exceptionnelle. La majeure partie des questions des amateurs sur ’Internet se font sur les milieux de soutien des tissus à couper avec le microtome type Ranvier.

2) Assez bonne qualité des coupes pour une étude anatomique détaillée des tiges, les pétioles, ovaires de beaucoup de fleurs, des feuilles, et ainsi de suite. Les feuilles se travaillent facilement avec la nouvelle configuration. Ce sont des sujets difficiles pour les microtomes traditionnels à main, pour ne pas parler des essais pour faire les sections à main levée. Le problème est, que pour une section s'étendant sur son côté coupé son épaisseur doit être plus fine que la hauteur de la lamina foliaire. La nouvelle configuration le permet.

Naturellement si vous travaillez avec du matériel peu épais, (une feuille par exemple) vous pouvez vous attendre à quelques mauvaise manipulations aboutissant à une lamina tordue, mais vous aurez toujours assez de matériel pour étudier l'anatomie de la feuille dans ce que vous aurez coupé.

3) Très bon marché. Cinq instruments nécessitent deux boîtes de lames de rasoir (5 rasoirs par boîte), pour un coût (à Cancún) de 5 centimes d'euros par tranchette)

4) Construction facile par les amateurs adultes soigneux. On n’a pas besoin de plus de 10 minutes pour faire et mettre en action une nouvelle tranchette à l'aide d’un séparateur de demi lame de rasoir, ou aux alentours de 20 minutes pour la version à bande adhésive plastique.

5) Utilisation facile. L'apprentissage est très rapide . N'importe quel utilisateur peut commencer à faire un bon travail en quelques minutes.

6) Assez sûr pour être employé sous la surveillance d’un adulte même par des lycéens.

LES INCONVENIENTS

1) Pas assez sûr pour être construit par des élèves ou des amateurs très jeunes, sans surveillance d’un adulte. Naturellement aucun microtome n'est sûr, et tous les modèles, professionnels ou amateurs sont aussi dangereux, et conviennent uniquement à l'usage d' adultes techniquement qualifiés.

2) Les coupes doivent être faites une à une. Vous devez remonter toutes les pièces, et faire la coupe très soigneusement, ouvrir l'instrument, et passer les coupe à leur usage final. Et répéter toute ces opérations à chaque fois....Mais êtes-vous très pressés ? Avez-vous besoin de beaucoup de coupes en série dans un temps limité ?

N'essayez pas de faire plusieurs coupes successives sans retirer la première. L'épaisseur de la première coupe ouvre les lames et chaque nouvelle coupe est plus large que la précédente.

3) Bulles d'air. Il est facile d'emprisonner des bulles d'air dans les cellules ou les vaisseaux exposés par le coupe, si vous coupez à sec dans l’air. La coupe sous l'eau évite ceci la plupart du temps. S'il reste quelques bulles, mettez les coupes dans une capsule de verre (une petite boîte de Pétri c'est mieux) dans environ 10 ml de glycérine à 50% et soumettez-les au four à micro-ondes. Dans un four domestique de 700 W, à 100% 10 à 12 secondes, vous débarrassent des bulles d'air. (Faites des évaluations comparatives pour les fours de 400, 600, ou 1000 W). De plus la chaleur produite par les micro-ondes fixe les tissus végétaux et clarifie les sections.

Un mot d’avertissement : les euphorbiacea et beaucoup d'autres plantes peuvent avoir des canaux lactifères chargés du latex qui s' écoule sur la surface des coupes comme un jus laiteux. En coupant sous l'eau et en agitant quelques secondes la coupe fraîchement faite, on se débarrasse généralement du latex.


CONCLUSIONS

Avec cette nouvelle configuration et en incluant les disques de contraste faciles à construire et bon marché, et un ou deux colorants que l'on peut trouver facilement dans les pharmacies, les tranchettes à double lame de rasoir méritent d’être introduites non seulement dans les laboratoires d'amateur, mais également dans les laboratoires d'écoles secondaires ou même supérieures.

De construction et d'utilisation simple, et d'une bonne qualité de coupe elles mettent entre les mains de chaque professeur la capacité de donner à ses étudiants les notions de base de l'anatomie des végétaux à un coût plus que raisonnable.

 

Utiliser cette technique est réellement un meilleur choix que d'utiliser :

- la méthode de coupes à main libre (potentiellement dangereux)
- la conception originale de Neuberg
- et les montages si recommandés aux USA, faits par soi même de vis et d'écrous.


GALLERIE

J'insère ici les images des espèces qui m'ont servi pour les illustrations.

 
13-basil 14-epipremmnum
Basilic. Ocinum basilicum
Epipremnum aureum. Un cultivar d'une plante grimpante tropicale
15-syngonium 16-hybiscus
Syngonium podophyllum - Une monocotylédone tropicale
La fleur d'hibiscus qui fait l'aimable donation d'un jeune fruit détaché.
Le feuillage... est celui d'Aptenia cordiflora

 

 

Les photos ont été prises en 1280 x 960 px avec une Samsung Digimax 201 et réduites ou découpées pour être insérées ici. Le feuillage au dessous de la fleur d'hibiscus est celui Aptenia cordiflora dont il sera longuement traité dans un prochain article.
 

  *Je préfère dire "des disques de contraste" parce que c'est plus court que "des obturateurs, des diaphragmes, et des filtres". Après tout ce sont des disques, ou sont montés sur des disques, pour être mis dans le porte filtres sous le condenseur du microscope.

WD

 

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