Nouveaux fixateurs sans formol

(1ère partie)

  Walter Dioni
Durango (Dgo) Mexique
 


La photo ci dessus est un amas sphérique de cellules, non identifiable comme un organisme quelconque, avec des nucleus de caractéristiques animales et cytoplasmes amoeboïdes, trouvé dans une préparation de matériel fixé avec Gala 60. Une très petite goutte de bleu brillant leur a donné cette couleur.


PREMIERE PARTIE

 

I
l y a peu d'années, a commencé la tendance à souligner les périls de beaucoup de substances utilisées normalement en microscopie depuis plus d’un siècle. Successivement ont été dénoncés : le formol, le glutaraldéhyde, le dichlorure mercurique, l’acide picrique, l’hydrate de chloral, l’acide phénique, le thymol, le violet de gentiane (ou cristal violet), le rose Bengale, le xylol, le benzol, le toluol, (xylène, benzène, toluène ) etc. etc..

La courte liste précédente prive d’ingrédients presque toutes les formules traditionnelles des réactifs pour la microscopie comprenant des fixateurs, des colorants, des agents éclaircissants et des milieux de montage.

Même dans un monde où les toxiques et les substances dangereuses envahissent les rues et les maisons (voyez les listes suivantes de substances de ménage dangereuses http://es.epa.gov/techinfo/facts/safe-fs.html, et pour ceux de nous qui doivent vivre dans les villes où nous sommes entourés par le brouillard industriel (smog) et les gaz toxiques émis par les automobiles (dont les composants principaux sont la triade célèbre de BTX (benzène ou benzol, toluène, et xylène) il n' est pas critiquable certainement ,d' essayer de défendre la santé des techniciens de laboratoire, qui passent 8 heures ou plus par jour, soumis a l'action des vapeurs de toutes ces substances dangereuses.

Comme mesure pour limiter l'usage des réactifs dangereux, les producteurs industriels vendent seulement aux maisons de grossistes, et ces derniers seulement aux grands distributeurs, qui a leur tour vendent seulement aux établissements professionnels. Les quantités minimum à commander (excessives pour un amateur) et les prix élevés dissuadent de toute commande.

Il est évident que, parallèlement, ces mesures préventives rigoureuses aient d'autres objectifs.

Quand j'avais 15 ans et que je faisais mes premières observations microscopiques des micro-invertébrés, j’étais allé à la pharmacie du coin, à deux blocs de mon adresse et très naïvement j’avais demandé 100 millilitres de Liqueur de Rousselet, selon la formule fournie par Langeron dans les « Précis de Microscopie », ma Bible.

Cette formule, qui ma été fournie sans la moindre objection par mon pharmacien de quartier, inclut 1 g de chlorhydrate de cocaïne ! De plus le prix n’était pas excessif !

Pour mes frottis de protozoaires ma formule favorite était le Schaudinn, dont les 2/3 sont constituée par une solution saturée de dichlorure de mercure, et je fixais les échantillons de trématodes que je tirais des batraciens de la mare d'un parc, dans le liquide de Bouin, fait avec de l'acide picrique et du formol, toujours selon les indications de ma Bible. Pour les rendre plus transparents et voir mieux leur anatomie j’ai employé le Chloralphenol et Carbolxylol, avec de lacide phénique. Pour le montage j’ai employé du baume du Canada dissous dans du Xylol.

Une seule minute de réflexion nous rappelle que le mercure est réellement terriblement dangereux (se souvenir de Minamata au Japon). Aujourd’hui même les thermomètres sont remplis d'alcool coloré. L'acide picrique, et les picrates à un moindre degré, l'hydrate chloral, et l'acide phénique, sont utilisables pour préparer les explosifs faits maison, et la cocaïne est une substance provoquant une terrible dépendance. Les dissolvants avec des hydrocarbures provoquent également une dépendance. Ils sont les favoris chez les jeunes gens.

La protection des histologistes est liée ainsi à la conception d'une protection sociale plus étendue.

Par conséquent, par des raisons légitimes ou collatérales, nous sommes soumis à des limitations qui exigent que notre esprit d'invention recherche de nouvelles solutions. Avec des substances non prohibées, accessibles à n'importe qui, amateur microscopiste ou étudiant, dans de petites quantités appropriées.

Personnellement je connais seulement une maison commerciale qui a pris le point de vue des microscopistes non professionnels, mais elle est en Angleterre, et, bien qu'elle déclare qu'elle peut fournir à tout le monde, dans beaucoup de pays les règles légales des impôts, des postes, et la même situation économique, empêchent de tirer profit de cette aide. (Voir dans Micscape le lien qui permet d' accéder à Brunnel)

J'ai commencé une série d'articles, déjà publiés ou qui vont être publiés dans Micscape Magazine, qui examinent les possibilités des amateurs pour les préparations faites maison
- 1) de milieux de montage, (Micscape Magazine, décembre, 2002, janvier, 2003, mars 2003)
- 2) de fixateurs pour différentes utilisations,
-
3) de colorants.

Cet article pour MicrOscOpieS présentera les formules et les caractéristiques de l'utilisation de mes deux premières formules expérimentales (une éditée: GALA, et une autre nouvelle). Cela, à mon avis, avec d'autres solutions alternatives déjà connues, que j’examinerai dans d‘autres articles), fourniront à l’amateur des outils pour mieux développer sa vocation.

Un moment de réflexion. Rien ne peut égaler la beauté de nos bébêtes quand elles sont vivantes. La microphotographie et le dessin sont les outils d'élection pour documenter leurs caractéristiques. On recourt à la fixation (et à la coloration aussi) seulement pour rechercher les détails qui ne sont pas visibles sur le vivant. Les nucleus de beaucoup de protistes ont une forme caractéristique, quelque fois même spécifique (cas des Euplotes, (Cilié hypotriche) par exemple) et il est très difficile de les déceler sur l’animal transparent et mobile. Les undulipodia (le nom moderne des cils et flagelles) ont un mouvement trop rapide pour qu’on puisse apprécier en détail leur disposition sur l’organisme vivant. Maintes organelles des rotifères changent beaucoup de forme dans le vivant.
De plus, s’il s’agit d'invertébrés un peu plus grands, comme les entomostracés ou les acariens, et maintes autres micro-arthropodes, par exemple, vous pouvez faire une collection d’échantillons pour être examinés un peu plus tard, quand vous avez l’occasion et la disposition de le faire. 
E
t certainement, pour ceux qui ont la chance d’avoir un microtome à disposition, même s’il est emprunté à une école ou à un ami universitaire, la fixation ouvre la possibilité d’investigation de la structure histologique des animaux.

GALA. (Glycérine, Acide acétique, Acide Lactique et Alcool)

C'est un fixateur doux que j'emploie dans deux versions. Le GALA 20 (qui a été déjà présenté dans mon article de décembre sur les milieux de montage publié dans MICSCAPE MAGAZINE) est utile pour les plus petits protistes d'étang sur lesquels je travaille au laboratoire. Il respecte la plupart du temps l'aspect normal, reconstituant au protoplasme mort une partie de sa transparence.


 


Dans une petite capsule j'ajoute 1-2 gouttes de GALA à 9-8 gouttes d'échantillon, laisse sédimenter les matériaux et les distribue sur mes porte objets. Habituellement dès que l'eau en excès s'est évaporée, je ferme la lamelle avec du vernis à ongles. Naturellement ceci me donne un très long temps pour étudier mes préparations.

 
 
Le fixateur met le macro-nucléus des protozoaires en évidence par une différence d’indice de réfraction. Les cils et flagelles sont visibles si vous jouez un peu avec l’illumination. Les végétaux (algues filamenteuses, desmidiales, diatomées) fixés quand ils sont vivants, conservent le vert des chloroplastes pour plusieurs jours (voir les desmidiales ci-joint). Les nématodes, les rotifères loricates, les gastrotriches, sont acceptablement fixés, bien que, sans anesthésie les gastrotriches peuvent s’enrouler et leur anatomie peut être difficile à déchiffrer. Comme avec touts les autres fixateurs que je connais les rotifères bdelloides se contractent en une masse ovoïde illisible. Étudiez-les vivants. Ils ne répondent même pas aux anesthésiques !

 
 
 




 


Un couple
de Paramecium en conjugaison et une probable Tetrahymena.

  Pour faire une étude complète de la majorité de ces groupes vous devez jouer avec les anesthésiques, les colorants et les éclaircissants. Ce sera la matière d’articles prochains.

Je ne garde pas longtemps mes échantillons dans le GALA 20. Il est pour moi une aide pour mieux connaître les détails de l’anatomie des créatures que j’étude préalablement sur le vivant et que j’enregistre avec ma webcam, vifs et fixées.

J'emploie le GALA 60 pour préserver mes échantillons pour une durée plus longue. Je concentre l'échantillon dans la moindre quantité d`eau que je peux, et j'ajoute avec une seringue hypodermique du GALA pour avoir 20% de fixateur dans le volume final.

 
 
échantillon, ml
4
8
12
16
20
GALA 60 ml
1
2
3
4
5

 

Ne laissez pas les échantillons dans le GALA 60 plus de 24 heures. De même il est habituel avec tous les fixateurs classiques, de remplacer le liquide par de l'alcool 50% (3 ou 4 heures) et de conserver l'échantillon dans l'alcool à 70%, avec quelques 2 à 5% de glycérine pour empêcher une évaporation occasionnelle de l'alcool et favoriser la transparence du protoplasme. Si votre matériel est très fragile, vous pouvez adjoindre une première étape d’alcool à 30%. Dans mon expérience le GALA 60 n'est pas bon pour préserver des copépodes, ou les branchiopodes, (tous les deux mieux connus des amateurs sous le nom de « puces d'eau ») : il n'est pas assez pénétrant. Il est possible que je n'aie pas employé la proportion appropriée de fixateur. Il y a matière à expérimenter. Ross Ferris, un amateur de la New Zealand, a expérimenté le GALA 20 avec très bons résultats dit il, pour l’observation de protozoaires et rotifères. 

 
       
 
Voici un Paramecium fixé au GALA 20. Le cytoplasme est bien plus opaque que dans le vivant. On peut modifier ceci en l'imprégnant de glycérine. Mais on peut reconnaître le macro-nucléus, le cytoplasme avec ses nombreuses vacuoles nutritives, le cytostome (en haut et a droite) la pellicule qui entoure le cytoplasme et les trychocistes explosés par le milieux acide.
 
 
Cliquez pour agrandir.    
 
Voici les formules. J'ajoute aux formules pour amateurs une formule professionnelle plus formelle.
 
GALA 20
GALA 60
Formule professionnelle
Acide lactique
1 ml
3 ml
3 ml
Ac. acétique au 5%*
10 ml
20 ml
1 ml acide acétique glacial
Alcool 96 
21 ml
63 ml
60 ml alcool absolu
Glycérol
5 ml
5 ml
5 ml
Eau
63 ml
9 ml

31 ml

* Oui, vous avez deviné. C’est du simple vinaigre commercial !

 
 

Préparation de la formule. GALA 20
 

- Ne soyez pas troublé par la basse concentration des substances actives dans la formule. Cela fonctionne.

Note : quand je parle d’eau je veux dire eau distillé, ou eau déminéralisé, du type que vous pouvez acheter dans le « supermarché » pour le fer à repasser de maman ou la batterie de l’automobile.

Mettez 100 ml d’eau dans un flacon approprié. Marquez le niveau exactement. Videz le flacon. Avec une seringue hypodermique de 20 ml prenez 1 ml d'acide lactique, 5 ml de glycérol, 10 ml de vinaigre (c'est à dire: 9,5 ml d'eau et 0,5 ml d'acide acétique). Agitez pour mélanger. Mettez le mélange dans le flacon. Aspirer quelques millilitres d'eau pour rincer la seringue, agiter et la vider dans le flacon, répéter une fois ou deux. Ajoutez l'alcool (21 ml à 96% = 20,2 ml d'alcool absolu et à peu prés 0,8 ml d'eau). Complétez maintenant le niveau du flacon avec de l'eau à la marque de 100 ml, et remuez jusqu'à ce que la solution soit homogène. Alternativement, si vous êtes dans le groupe des microscopistes amateur "riches", employez vos pipettes de mesure et cylindres gradués, pour préparer votre formule.

Montage des matériaux fixés au GALA

Beaucoup des matériaux peuvent être montés dans des milieux solidifiables, comme la fructose, le vernis à ongles, les milieux à la gomme arabique, etc.

Mais un cas spécial est le montage des micro invertébrés microscopiques mélangés, avec beaucoup de détritus, qui en raison de leur très petite taille ne peuvent pas être manipulés individuellement, ou être classés dans des groupes uniformes, et doivent être montés dans quelques milieux liquides.

Ce qui suit, bien que non facile à appliquer, est un protocole utile.

a. Fixez et préservez les matériaux dans un fixateur approprié (le GALA est une bonne alternative). Accordez vous au moins 6 heures pour une bonne fixation.

b. Regardez l'échantillon au micro pour voir s’il y a les créatures que vous cherchez. S'il y a besoin de colorer (attendez un futur article) c’est maintenant qu’on doit le faire.

c. Prenez un échantillon (disons 19 gouttes). Ajoutez 1 goutte de glycérine et mélangez très bien après l'addition. Vous avez maintenant une solution avec 5% de glycérine. Mettre de côté pendant 15 minutes.

d. Ajoutez une nouvelle goutte de glycérine, mélangez et laissait agir pendant 15 minutes. La concentration est maintenant de près de 10%.

e. Avec une seringue et une aiguille hypodermique fine enlevez la moitié du liquide surnageant. Si vous travaillez avec soin vous avez maintenant 10 gouttes, avec approximativement 9 gouttes d'échantillon et 1 goutte de glycérine. (glyc. à 10%.) Ajoutez 2 gouttes de glycérine et mélangez bien. Ceci s'élève à 12 gouttes (9 + 3) de glycérine de 33% (aproximativement). Mettre de côté pendant au moins 15 minutes.

e. À mesure que la densité du liquide augmente, le temps de sédimentation est plus long. Donnez assez de temps pour que presque tout votre échantillon tombe au fond du tube à essai ou au fond concave de la capsule.

f. Maintenant prenez un porte-objet (une lame) propre et mettez une goutte du sédiment concentré au centre. Mélangez bien avec une autre goutte de glycérine pure, et couvrez avec le couvre-objet (la lamelle). Vous devez faire une évaluation juste des volumes pour avoir une préparation très mince mais remplissant complètement la lamelle jusqu'aux bords. (Pour maints protistes cette nouvelle addition et inutile, la concentration de 33% est suffisante)

g. Scellez la lamelle si vous voulez. La méthode n'est pas rapide, ni facile, mais vous donne des préparations très bonnes de beaucoup de micro-invertébrés difficiles à préserver

NOTES: Rendez vos préparations aussi minces que vous pouvez. La résolution est altérée dans les préparations liquides épaisses, et également l’épaisseur affecte la qualité du scellage. Accordez toujours assez de temps pour que le mastic puisse sécher complètement. N'employez jamais l'objectif de 100x IH (si vous avez un), avec les préparations non scellées

 
 

La même méthode de montage à la glycérine est utile pour les matériels fixés au lacto-cuprique, ou à l'eau chaude, qui seront étudiés par la suite.

De même que la glycérine vous pouvez utiliser le sirop de fructose, ou les milieux de montage à l'alcool polyvinylique, tous miscibles à l'eau, dont deux formules (PVA-L avec acide lactique et PVA-G avec de la glycérine) seront présentées dans la troisième partie (b) de ma série sur les milieux de montage (qui va être publié en avril)

 
 


FIXATEUR LACTOCUPRIQUE
 :

J'avais aussi besoin d'un fixateur qui préserve également les tissus des animaux et plantes microscopiques. Le mercure et le formol sont interdits, et je pense a l’alcool, aux acides, et d'autres métaux lourds, qui tous précipitent les protéines, ce qui est l’essence de la fixation. (Bien que les aldéhydes ne précipitent pas, ils font des liaisons entre les chaînes de protéine (cross-linking), mais ils sont interdits) Le Zinc a été proposé, essayé, et trouvé utile, comme un additif substitutif du mercure dans des formules histologiques avec formol. Je ne peux pas trouver facilement des sels solubles de Zinc à Durango. Ainsi j'ai recouru à un métal qui a causé l’agressivité et l’hilarité de quelque histologiste qui ont répondu dans Histonet, alors qu'il était employé par un technicien pour cet usage dans un échantillon d’urgence pathologique: le Cuivre.

Le résultat c’est mon fixateur Lactocuprique

 

Il tue les copépodes et les cladocères dans presque le même temps que l'alcool de 70% (qui est le fixateur d’élection pour les entomostracés) préserve bien l’anatomie interne, les cellules avec les nucleus dont la chromatine est bien fixée, maintient l'aspect général, y compris les ovisacs non collapsés, et ceci pendant plus de 24 heures, même en étant un fixateur très acide. On peut discerner les cellules de l’ovaire, des testicules et des muscles.

Oeuf de Daphnie, dans la chambre incubatrice du Cladocère.
On voit les nucléus des futurs tissus.
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D'ailleurs il a fixé le reste de la microfaune dans les échantillons presque comme le GALA. Toutes les algues dans les échantillons, et les échantillons d'épiderme de feuilles que j’aie essayé, conservent la couleur verte des chloroplastes.

Pour étudier les matériaux fixés on peut appliquer un protocole similaire a ce qui a été spécifié pour GALA

     
 

A gauche on a un petit amas d'algues (diatomées, en haut, à droite: cyanophycées, en bas à gauche et chlorophycées au centre, un mois après avoir été fixées au LC et montées dans la glycérine pure.

 

A droite c'est l'épithélium de l'envers d'une feuille, ( à 1000X) fixé au LC et monté au fructose, on voit les chloroplastes des cellules de garde d'un stomate et le nucléus d'une cellule (a gauche).La chlorophylle peut encore se reconnaître après un mois.

  Je ne prends pas de risques et pour les petits crustacées et d’autres matériaux calcifiés je transfère la majeure partie des échantillons dans de l'alcool à 70% après pas plus de 24 heures. (Mais voir aussi la légende de la Daphnie a la fin de cet article) Ceci naturellement élimine le vert. Mais je maintiens aussi quelques préparations montées dans la glycérine ou dans le fructose, après avoir été fixées avec le Lactocuprique. Le vert perdure pendant quelques semaines au moins. J’en ai quelque unes avec plus de deux mois d'âge.
 
     
 

A gauche, c'est une photo prise à l'Immersion Homogène (x1000) du bord du sac d'oeufs d'un copépode. Les sujets de la photo sont certainement de très petits ciliés peritriches coloniaux a pédoncule rigide fixés sur les oeufs.

A droite on voit les cellules des tissus sous la carapace du copépode . Ce sont très probablement des ovocytes en développement dans l'ovaire
 


Mon expérience est cependant très limitée, et je n'ai pas essayé avec des animaux plus volumineux ou des végétaux, ni des sujets plus sérieux en tant que standard histologique. C'est vraiment une tâche pour une plus grande équipe que pour un seul amateur. Je pense à la liste du groupe Microscopies, toujours si actif et intéressé, comme la plus indiquée pour faire une expérimentation extensive dans un temps assez court. Voici la formule du:

LactoCuprique

Acide lactique............  1 ml
Ac. acétique 5%......... 6 ml
Eau............................. 93 ml
Sulfate de cuivre...... 5 g 
 
 

Peter Gray, dans son vieux mais toujours utile « The microtomist formulary and guide » présente plus de 20 formules avec sels de cuivre (nitrate et chlorure) mais mélangés avec le formol. Il y a longtemps que Blaydes (et bien d’autres a la suite) a modifié l’AFA (alcool-formol-acid acétique) en ajoutant du sulfate de cuivre. Bien que Gray réclame pour le cuivre un rôle important dans la fixation de protéines, le cuivre n’avait eu de chance. Il était relégué au rôle de fixateur de la chlorophylle.

 
 
Brachionus bidentata
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Squatinelle sp probable
Platyas quadricornis
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Les images de Brachionus et Platyas ont été composités avec CombineZ
 


Jean-Marie Cavanihac m’a communique une formule, que Deflandre recommande dans son beau et trop petit livre (mon premier livre de microscopie), pour fixer les algues microscopiques. Elle est aussi parfaitement sûre. Je ne peux pas trouver ces sels à Durango
(pour les prix que je peux payer).

C’est a vous de l’expérimenter :

0,2 gramme nitrate de cuivre

0,3 gramme dichlorure de cuivre
1 gramme acide acétique
100 ml eau

Peut servir directement de milieu de montage (si vous luttez votre préparation)

Une daphnie avec sa chambre incubatrice pleine d'oeufs montée au PVA-G
Au contraire de ce que je conseille, cet échantillon fut conservé (comme essai) dans le même LC pendant plus de deux mois avant le montage. Elle est en bonne condition. Mais il est bon de ne pas tenter le diable.

Cette image finale est bien sûr une Vorticella avec son pédoncule semi-contracté et son nucléus en fer à cheval.

Il y eut besoin d'amalgamer 3 photos pour bien démontrer la souplesse du pédoncule.

 

Çela fait que je me souviens d’une autre vielle formule : le Lactophenol cuproacetique

Le lactophenol est dangereux par le phénol de sa formule, mais on peut utiliser de la glycérine en son lieu (voir mon premier article sur les milieux de montage : Lactoglycerol) et la formule peut être modernisé:

Lactoglycerol cuproacetique

Lactoglycerol……………………….. .50 ml
Eau………………………...……………….. 95 ml
Bichlorure cuprique………………2 g
Acétate de cuivre……………...…2 g
 

Ajoutez 6 – 10% au liquide avec les algues. Vous pouvez conserver votre collection indéfiniment dans ce liquide. Mais, si vous voulez, vous pouvez monter vos algues dans les PVA (lactique ou glycériné) ou avec un peu plus de difficulté dans la gélatine glycériné.


 
     

 

Passez alors à la partie suivante si vous voulez d’autres méthodes de fixation non dangereuses.