Nouveaux fixateurs sans formol

(2éme partie)

Walter  Dioni                             

    Durango (Dgo) Mexique

 
Je veux montrer ici trois méthodes de fixation d'utilisation assez générale qui peuvent complémenter les formules que j'ai présentées dans la première partie. Ce sont encore des fixateurs pour l’utilisation de microscopistes biologistes, non histologistes. Bien qu'il soit certain que certains des fixateurs  utilisés par les histologues peuvent être très utiles pour microzoologistes et microbotanistes, il est mieux que les fixateurs pour histologie sans produits toxiques soient présentés dans un autre article, par la suite, si j'ai du succès dans les essais que j'effectue maintenant. (Fixateurs histologiques non commerciaux, ça va sans dire, parce qu'il y a plusieurs produits commerciaux qui sont vendus à prix d'or pour les laboratoires professionnels, et qui soutiennent être suffisamment sûrs pour l'utilisation courante)
 
 
(Note: La plupart des images sont cliquables)
 


ALCOOL 70

 

 
C'est un fixateur standard pour beaucoup de groupes, particulièrement les arthropodes. Il se comporte bien avec des insectes, arachnides, crustacés et de plus grands animaux. Il est sûr (si vous ne buvez pas plus de deux verres de vin par jour !) et les échantillons fixés sont très durables. Mais il y a un grand défaut, en les déshydratant  il contracte  beaucoup les tissus, et, employé seul, il est inutilisable avec la microfaune plus petite qui est la plupart du temps méconnaissable juste après la fixation.
 

Antenne de cladocere amalgamé avec

AstroStack 2.1 - cliquez l’image pour voir l’original

 

Si vous voulez avoir votre échantillon fixé dans l'Alcool à 70% votre technique variera selon son type. Mais la loi générale c’est d’estimer le volume du matériel (plancton, sédiments, algues, etc.) à fixer, en incluant l’eau de l’échantillon. Puis vous ajoutez  suffisamment d’alcool à 90% ou 96% pour obtenir le degré désiré. La table ci dessous est une aide pour faire les dilutions à 70 % : Ne soyez pas surpris par les chiffres. La table tient compte de la quantité d’eau dans l’alcool ajouté. Le volume final s’ajoute pour que vous placiez l’échantillon dans un flacon approprié.

 

 
Échantillon (ml)
5
10
15
20
25
alcool 96 (ml)
13.5
27
40
54
67
Vol. final (ml)
18.5
37
55
74
92
Alcool 90 (ml)
17.5
35
52.5
70
87.5
Vol. final (ml)
22.5
45
67.5
90
112.5
 

 

L’alcool sanitaire au 70% ne convient que pour des échantillons que vous pouvez  égoutter presque totalement. Des insectes, petits poissons, des têtards, ou même les entomostracés péchés avec votre filet et bien essuyés. Comme l’eau de l’échantillon va diluer votre alcool, n’oubliez pas de faire un ou deux changements par de l'alcool nouveau après 18 à 24 heures.

 
 


L’alcool est un fixateur « macroscopique ». Il ne fixe pas bien les nucleus. Pour améliorer la fixation, on ajoute de l’acide acétique. L’acide fixe très bien les nucleus et de plus il gonfle un peu les tissus. Une formulation fut proposée par Wolman pour fixer les sections faites au microtome par congélation.

 

            Alcool 96%.........................95 ml

            Acide acétique…………….5 ml

 

Cette formule est, certainement d’un usage plus général.

 

Mais, si vous ne prétendez pas faire de l’histologie, ni faire des descriptions taxonomiques avec dimensions très exactes vous pouvez utiliser l’alcool simple.

Rotifère prob. du genre Pseudopleosoma

 

 
 

 

L’alcool méthylique qui était bon marché fut utilisé autrefois principalement comme un dénaturant du « bon » alcool éthylique, pour éviter l’ingestion. Ne buvez pas de l’alcool méthylique, c’est mortel. Mais récemment dans beaucoup de travaux il est reconnu que le méthylique est réellement supérieur à l’éthylique, comme fixateur et il est proposé comme un substitut total ou partiel dans des formules classiques. Une d’elles c’est le Carnoy, qui est aujourd’hui  dénomme Methacarn, avec sa formule modifiée :

 

                                               Alcool méthylique……..…60 ml

                                               Chloroforme………………30 ml

                                               Acide acétique……………10 ml

 

Par sa pénétration rapide le Carnoy, et actuellement le Methacarn sont utilisés pour des organismes chitinisés, et pour des tissus utilisés dans l’investigation génétique (racines végétales, anthères, boutons de fleurs, testicules et ovaires, œufs d’insectes, etc.) Les alcools utilisés dans ces formules, tant l’éthylique que le méthylique doivent être absolus. L’éthylique absolu est très cher, mais le méthylique absolu est la présentation la plus normale.

 
       
       
microalgues
2 Euglena deses
Nauplius de copépode
 


Quelque’uns rejettent l’éthylique et utilisent exclusivement le méthylique (un peu plus bon marché) ou l’isopropylique (un peu plus cher)

 

Vous voyez que les alcools commerciaux dénaturés avec un autre alcool son parfaitement adéquats pour la microscopie amateur. Il n’est pas de même quand le dénaturalisant est  une essence ou une autre substance qui mêlée avec de l’eau devient opalescente.

 

 

 

 

DE L’EAU CHAUDE

 
Je crois que l’eau chaude (la chaleur réellement) fut recommandée autour des années 30’ du siècle antérieur (oui, du vingtième !). Mais a été acceptée réellement dans les 20 dernières années du siècle. Surtout les helminthologistes l’emploient couramment. On dit que le traitement par l’eau chaude fixe les animaux avec leur aspect normal, en extension, sans déformations, et  en gardant les vraies dimensions, ce qui est très important pour une bonne taxonomie.
 
 

 

 

Vous pouvez mettre vos créatures sur le porte-objet dans une goutte d’eau et chauffer par-dessous avec une allumette ou un briquet. L’objectif c’est d’obtenir une température aux alentours de 50-60 ºC. Les tardigrades, les trématodes, les petits cestodes, les nématodes, les hirudinées, et d’autres microinvertébrés répondent très bien à cette manœuvre. Avec les helminthes plus grands vous pouvez même chauffer le fixateur et  le verser sur les vers dans un cristallisoir.

 
Rotifère, prob. du genre Epiphanes
Euglena deses
 

Pour les protistes les plus petits vous mettez l’échantillon, préférablement concentré par filtration, dans un récipient qui accepte quatre fois le même volume. Vous attendez que les animaux (rotifères, gastrotriches, nématodes, protozoaires, etc.) reprennent leur activité normale, et vous ajoutez soudainement un volume double d’eau presque bouillante. Comme le dit Edmondson (1959) l’endroit où vous avez versé l’eau est sûrement surcuit, et le bord du récipient n’a pas reçu une chaleur suffisante, mais un cercle situé entre les deux zones présentera des animaux dans un état d’extension parfaite. Oui, vous avez la tâche de les chercher goutte a goutte, mais Edmondson dit que c’est l’unique méthode qui permette  de fixer quelque exemplaire de Notommata (un rotifère très difficile de fixer) avec ses « auricules » bien étalées.

  Généralement (je le fais toujours, et je vous conseille de faire de même) après  la fixation par l’eau chaude, on fait une post fixation avec un fixateur conventionnel (alcool 70% pour les entomostracés, lactocuprique pour les plus petites invertébrés, etc. selon les espèces).
 
Lepadella sp.
Mytilina cf. mucronata
 


Les professionnels et bien sur quelques amateurs fixent quelques matériels, (essentiellement pour l’histologie), avec le four a micro ondes. Cela exige certainement ou un four « de laboratoire » ou la calibration soigneuse de votre four domestique. C’est possible de le faire. J’ai calibré le mien.

Mai les temps pour les très petites quantités de matériels qui y sont utilisées  sont si courtes et le réglage si difficile (par la distribution irrégulière de la radiation dans la chambre du four), que j’ai

 renoncé après avoir cuit bien des nématodes, rotifères et protozoaires. Le four sert à chauffer l’eau

 ou le fixateur qui vous pouvez utiliser, ou a sécher le lutage de vos lamelles (soyez  très prudents, commencez par pas plus de 5 secondes d’exposition a 100%). Si vous voulez chauffer un plus grand échantillon le développement de la température (même si elle est atteinte en 2 minutes) est graduel et non instantané comme quand vous ajoutez de l’eau presque bouillante, le facteur surprise et perdu et vos sujets peuvent se contracter.

 

Diatomée le jour suivant au traitement par l’eau chaude.

 

 

Le copépode fut photographie avec l’objective 40X. J’ai pris 10 images et les ai composé dans PhotoPaint. L’image originale a 1028 x 2000 pixels. Cliquez sur l’ícone de gauche pour voir une image à 55 % de l’originale.

 

La couleur est produite naturellement par les caroténoïdes de la carapace cuits par l’eau chaude.

 

J’ai replacé le fond des images, qui était malpropre

 

CLIQUEZ SUR LES IMAGES POUR AGRANDIR
     

Une amibe surprise par l’eau chaude

Obj. X100 immersion



Fixateur de Rhode  (« Lugol »)

Formule :
Iode métallique 5 g
Iodure de Potassium 10 g
Acide Acétique 10 ml
Eau 100 ml

 

Gardez dans des flacons bruns ou opaques. Ajoutez 0.5 ml à 100 ml d’échantillon.

         
 
  Tous ceux qui travaillent avec des échantillons de plancton connaissent le « Lugol » qui est employé pour les fixer. C’est réellement du Rhode  (Lugol concentré presque 10 fois + acide acétique, ou acétate de potassium) qui s’emploie. Il est très approprié pour conserver le phytoplancton, les protozoaires et les rotifères du plancton, auxquels l’Iode (un métal lourd) ajoute à la pesanteur, et les fait précipiter rapidement, pour permettre la concentration.  
 
Brachionus quadridentatus
   
 
Les planctologistes prennent leurs échantillons, mettent des sub échantillons dans des cylindres spéciaux et laissent précipiter au fond tous les organismes. Le fond des cylindres à l’épaisseur d’une lamelle et permet l’observation des organismes avec un microscope inversé.
 
    Vous n’avez pas un microscope inversé ? C’est une des techniques que vous pouvez appliquer pour étudier le micro phyto et zooplancton. Utiliser une bouteille de 1 ou 2 lt. Préférablement en verre et a fond plat.  Ajoutez 5 ml de Rhode, bien mélanger et laissez dans l’obscurité pour 2-3 jours. Avec un tube flexible improvisez un siphon et décantez l’eau surnageante laissant au fond un dixième du volume initial sans agiter le sédiment. Remuez, et transvasez dans un flacon cylindrique. Apres deux jours décantez et prenez des gouttes du sédiment du fond pour les examiner au microscope.
 
     
Microalgues et bacteries precipitées
 
   

Vous serez étonnés de la grande quantité de phytoplancton divers et même du petit zooplancton que vous pouvez déceler maintenant.

 

Les échantillons fixés avec Rhode peuvent se conserver pendant quelques semaines, protégés de la lumière. Mais les organismes prennent une teinte brune qui peut gêner l’observation. On leur restituera la transparence avec quelques  gouttes d’une solution de thiosulfate (hyposulfite) de potassium au 5-8%.

 
 
Pour ceux qui vont faire seulement quelques essais je donne ici une formule qui m’a donné de bons résultats, mais qui dépend de la qualité de la teinture d’iode médicinale que vous trouvez dans votre pharmacie.

Je pars d’une teinture commerciale de formule :

 

Iode métallique   
1.2 g
Iodure de potassium         1.5 g
Excipient     60 ml 
Cliquez sur la photo pou voire l’explication
J’ajoute 50 ml de vinaigre (sol. d’acide acétique a 5%)
 

Ma formule finale est :

Iode 1.2 g  
Iodure   1.5 g  
Acide acétique    2.5 g  
Eau (+ excipient)    110 ml 

Ce qui est plus ou moins un Rhode 4 fois dilué, en prenant compte des ingrédients réellement actifs. Pour 100 ml d’échantillon j’ajoute 4 ml de cette  formule alternative. Si vous voulez essayer cette voie étudiez la formule de « votre » teinture d’iode médicinale et procédez de même.

 
     
 
 
 
Une autre colection de diatomées, cloroficées, et bacteries
 

NOTE : quand vous travaillez avec les autres fixateurs, les cils des ciliés et d’autres invertébrés sont presque invisibles. Maintes fois vous pouvez les mettre en évidence ajoutant une simple trace de Rhode à votre montage. Soyez  prudents : seulement une trace. Cela peut mettre en évidence les cils, les nucleus et aussi les flagelles.
 
           
     
 
Scenedesmus sp.
 
Un filament de Melosira sp.
 
Astasia sp.
           
 
 

D’autres images:

La plus interesante est celle d’Astasia, un flagellé sans chloroplasts qui ne produit amidon et pourtant ne prendre de la couleur avec l’iode.

 
 
Phacus pyrum
   
Euglena sp.
           

 

CONCLUSION :

 
l y a d'autres formules et méthodes, mais vous avez déjà diverses alternatives sans aucun ingrédient dangereux, qui vont vous permettre le travail avec d’innombrables microinvertébrés, si elles sont utilisées avec sagesse.

 
 
 
 
Cliquez sur la photo pour voir l’explication sur ce gastrotriche
 

 

UNE ALTERNATIVE POUR LES AMATEURS EXPERIMENTES

 ET SOIGNEUX


 

 

 
 

 

Le formol est un produit maintenant interdit, parce qu'il semble être cancérigène, mais qui pour des raisons techniques, continue à être utilisé dans beaucoup de laboratoires professionnels. Il doit être conservé en bouteille bien close, préférablement séparé des autres réactifs d’usage courant, il ne doit pas être mesuré avec des pipettes a succion buccale, et vous devez travailler pour faire les dilutions dans une aire bien ventilée. Protégez vos yeux et votre peau du contact direct. Evitez d’aspirer les vapeurs.  C’est un fixateur, c’est à dire un tueur de cellules.

 

Ceci dit, je dois reconnaître que lui, et le glutaraldéhyde (plus dangereux encore que le formol et bien plus cher), sont les meilleurs fixateurs que je n’ai jamais utilisés. Il y a déjà quarante années que j’ai conçu une petite méthode pour l’examen rapide et temporaire des échantillons prélevés sur les végétaux submergé, sur les pierres submergées (matériaux tous deux mieux nommés « perifiton »), au milieux des algues et plantes flottantes, ou dans les petits récipients pleins d’eau qui se forment a la base des feuilles des broméliacées. Le voila :

 

 
 

REACTIFS

 

A)    Fixateur

Alcool 96%                         58 ml

Formol                                 5 ml

Eau                                       37 ml

B)    Vert méthyle

Vinaigre                               20 ml

Vert méthyle                       1 g

Eau                                       80 m

C)    Eosine

Solution d’éosine 2%      50 ml

Vinaigre                               20 ml

Eau                                       30 ml

 

 
 

Pour colorer le nucleus

 

                        Mélanger 7 gouttes de fixateur, avec 3 gouttes de vert méthyle

Utiliser une goutte de cette solution mélangée avec une goutte d’échantillon et une petite goutte de glycérine

 

Pour colorer les cils et le cytoplasme

 

                        Mélanger 9 gouttes de fixateur et 1 goutte d’éosine

Utiliser une goutte de solution mélangée avec 1 goutte d’échantillon et une petite goutte de glycérine.

 

Vous pouvez aussi préparer une solution double

                       

Mélanger 8 gouttes de fixateur, 1 goutte de vert méthyle, et une goutte d’éosine. C'est très utile, mais cette solution double précipite après quelques heures.

 

Je l’ai conçue pour étudier les protozoaires, mais, étant une solution de formol a 5% dans l’alcool 60 %, elle peut être utile pour tout autre microinvertébré.

 

Bonne chasse !

 
 
(WD)