Seul un réglage correct de l'éclairage selon la méthode de Köhler peut vous permettre d'obtenir une image de qualité fournissant à la fois la meilleure résolution et le meilleur contraste. Ce réglage devra être renouvelé à chaque changement d'objectif à l'exception du centrage de la source lumineuse qui ne sera effectué qu'après un changement de la lampe ou un démontage de l'éclairage.

Il s'agit d'amener en agissant sur la vis de hauteur du condenseur, l'image du diaphragme de champ sur la préparation mise au point.

• Allumer le système d'éclairage du microscope.
• Enlever le filtre dépoli.
• Laisser en place la lentille amovible du condenseur si elle existe.
• Positionner un objectif 10 X.
• Mettre l'oeil à l'oculaire.
• Faire la mise au point sur une préparation bien contrastée à l'aide du mouvement rapide puis lent.
• Écarter l'objet du champ avec les commandes de la surplatine pour n'avoir qu'un champ uniformément éclairé.
• Ouvir à moitié le diaphragme de champ.
• Remonter au maximum le condenseur grâce à sa commande de hauteur.
• Faire la mise au point sur le bord du diaphragme de champ avec la commande du condenseur.

Le principe de l'éclairage de Köhler est de projeter l'image de la source lumineuse dans le plan du diaphragme d'ouverture. Il faut donc que la source tout comme les autres éléments optiques soit centrée et couvre entièrement le champ du diaphragme d'ouverture.
Le filament de tungstène formé de spires serrées est considéré comme une source punctiforme par opposition à une source étendue comme la lumière d'une flamme ou la lumière du jour.
Pour régler la source, il faut supprimer les filtres dépolis ce qui n'est pas toujours possible dans le cas, par exemple où c'est le collecteur lui-même qui est dépoli.

• Centrer le filament à l'aide des vis de centrage de la lampe, tout comme pour le condenseur.
• Régler l'éloignement de la lampe par rapport au collecteur de manière à ce qu'il couvre tout le champ lumineux.

Le rôle du diaphragme d'ouverture est capital car il règle le degré de cohérence de la lumière.
Si le champ délimité par le diaphragme d'ouverture couvre intégralement le plan focal arrière de l'objectif, on obtient une résolution maximale puisqu'on exploite toute l'ON de l'objectif mais l'image n'est pas contrastée.
On a donc l'habitude de n'éclairer que 50 % à 75 % du plan focal arrière de l'objectif en fonction de la nature de l'objet.

• Enlever un oculaire et regarder dans le tube.
• (Ou bien utiliser la lentille de Bertrand si le microscope en est pourvu.)
• (Ou bien encore utiliser la lunette de réglage des anneaux de phase.)
• Fermer plus ou moins le diaphragme d'ouverture afin de couvrir les 3/4 de la surface du champ visible.
• Remettre l'oculaire, l'éclairage est maintenant réglé.
  

• dévolter le filament, mais dans ce cas on change la température de couleur de la source
• ou utiliser deux filtres polarisants superposées plus ou moins croisés.
• ou interposer des filtres neutres ( de densité ) ou un filtre interférentiel .

A l'exclusion du réglage du filament, répéter tous les réglages à chaque changement d'objectif.
Cela ne prend pas beaucoup de temps.
Pour les objectifs faibles, inférieurs à 10 X, basculer la lentille amovible du condenseur.
En l absence de lentille amovible, jouer avec la hauteur du condenseur et les diaphragmes pour éclairer toute la surface couverte par l'objectif, mais les conditions de Köhler ne seront plus remplies.
Ne pas oublier de remettre la lentille amovible et de refaire les réglages pour les objectifs supérieurs ou égaux à 10 X.