PREPARATIONS DE PIECES ANATOMIQUES

D'INSECTES

  Jean LEGRAND

Je ne vais pas commencer par vous décourager tout de suite, mais disons dès le départ que la préparation de petits insectes ou de pièces anatomiques d'insectes est extrêmement intéressante par les techniques qu'elle met en jeu et les résultats passionnants qu'elle apporte, mais elle est difficile,très longue, délicate, et demande une patience incroyable, d'autant que les résultats ne sont pas garantis à chaque fois ...

BUTS A ATTEINDRE

Les objets destinés à être observés au microscope, doivent, par définition être transparents et le  plus minces possible; ce n'est pas le cas des insectes, qui même petits, sont opaques. Il va donc falloir leur faire subir un traitement qui vise à les "vider" de leurs substance interne pour ne conserver que l'exosquelette chitineux, qui, lui, devra le plus souvent subir un traitement éclaircissant. Ensuite, il faudra réduire au maximum l'épaisseur des objets pour les rendre compatibles avec un montage entre lame et lamelle. Bien sûr, on peut se contenter d'une observation temporaire, mais quand on réussi une " belle " préparation, il y a relativement peu de chose à faire pour rendre cette préparation définitive, ce qui  en vaut la peine et permet de conserver un long travail.

QU' OBSERVER ?

Pour rester dans notre domaine de la microscopie, de nombreux sujets dont la dimension n'excède pas 2mm peuvent être observés entiers. C'est le cas de nombreux petits acariens, puces, poux,tiques, thrips ( petits insectes vivant dans les vieux livres ), araignées,aoûtats,et bien d'autres. Pour les plus gros, ce sont les pièces détachées, si j'ose dire, qui apportent des observations passionnantes ! Pattes, articulations, cerques,antennes,pièces buccales,etc !

MATERIEL

 Outre les boîtes, flacons, tubes et autre engins de " chasse ", ce genre de préparations demande un minimum d'outillage indispensable pour mener à bien de fort délicates manipulations.

Dans mon coin microscopie, je dispose également d'une loupe sur pied et d'un loupe binoculaire (x10),
ce qui n'est pas strictement indispensable, mais contribue au confort du travail !

EN GUISE DE PREFACE

Je reprends pour rédiger ce texte des notes accumulées depuis pas mal de temps ( certaines datent des années 80...), par moi-même et par un ami alors aussi passionné que moi. Ces expériences conduites ensemble nous ont amené à nous forger une méthode, qui ne prétend pas être exhaustive, ni la seule possible,mais uniquement basée sur la pratique que nous avons pu acquérir,méthode que personnellement j'utilise toujours !
Je n'ai finalement jamais rien entrepris de vraiment extraordinaire : essentiellement ailes, pattes,antennes, aiguillons, poches à venin...tous sujets dont j'ai maintenant une expérience convenable...J'envisage bien d'aborder des points plus délicats : j'ai en réserve quelques cas qui m'intéressent, comme ces  notonectes qui m'attendent dans l'alcool depuis quelques années !
Il faut, une fois encore, énormément de soin et de méthode, et une longue série d'opérations que je résumerai comme suit : utilisation d'animaux fraîchement euthanasiés ( acétate d'éthyle ) ou conservés dans l'alcool à 70°, immobilisation sur une plaque de liège avec quelques épingles d'entomologiste, mise en place et orientation des pièces avec une aiguille emmanchée,coupe avec des ciseaux très fins ( j'ai quelques outils de chirurgie ophtalmologique ! ),ceci sous la loupe. Une fois les appendices enlevés, je coupe, sur une lame et au scalpel, soit la tête ( très difficile à préparer ! ) soit l'extrémité de l'abdomen pour retirer dard, aiguillon ou poche à venin, ce qui est loin de réussir toujours...J'ai réussi à isoler des pièces buccales de taon, une langue de bourdon, je sais récupérer relativement facilement, avec une aiguille, une trompe de papillon, mais je suis encore loin de séparer les tubes de Malpighi ou les glandes salivaires !
Mais tout ceci n'est qu'un début, car les pièces ainsi séparées, exception faite des ailes, ne permettent jamais un examen direct : c'est épais et opaque...L'examen en épiscopie ne donne rien de valable.
Certaines pièces peuvent être traitées au chloralphénol (avec passage ultérieur facile au baume du Canada) mais en général, pour aboutir à des préparations claires et agréables à observer, c'est le traitement par la soude caustique à 10% qui donne les meilleurs résultats. Durée de quelques heures à quelques semaines ou même quelques mois selon la nature du sujet, contrôles fréquents au microscope, lavages et compressions ménagées entre lames pour vider l'intérieur et amincir suffisamment. De nombreux essais sont nécessaires pour aboutir à une pratique qui conduira à de bons résultats. L'observation est alors possible dans de bonnes conditions. Mais quand on a réalisé toutes ces opérations, il serait navrant de ne pas continuer jusqu'à la préparation définitive ! Il faut alors laver, déshydrater par les alcools, ( on peut éviter la difficulté de l'alcool absolu par l'intermédiaire du chloralphénol ou du xylène phénolé  ), passer par le xylène et monter au baume. Le montage recèle aussi pas mal de pièges : trop ou trop peu de médium, bulles d'air, etc., mais quelle satisfaction quand on a  réussi une belle préparation qui va se conserver longtemps ! Alors il vaut mieux savoir dans quoi on se lance : il est préférable de faire ses premiers pas avec ailes et pattes...de mouche !

LA PREPARATION

* Séparation des pièces ( pattes, ailes, appendices, etc. ) le plus près possible du corps, avec des ciseaux très fins, genre ciseaux de brodeuse,coupant bien, en très bon état.

* Immersion dans une solution à 10% de soude caustique, à la température ambiante. Il suffit de très peu de liquide, et on peut opérer dans n'importe quel petit récipient, bien bouché. Ma préférence va à de petits tubes à essais, de 6x1 cm, avec bouchon en caoutchouc. Attention : la soude caustique est un produit très dangereux, surtout en cas de projection dans les yeux ;éviter aussi tout contact avec la peau. Le port de gants est recommandé. Au début, les pièces commencent à flotter, puis elles plongent au bout de 2 à 10 heures. Pour les sujets "courants" une immersion moyenne de 3 jours est en général suffisante. On peut sans inconvénient, en cas de doute, maintenir le contact pendant une semaine, voire plus, ce qui ne peut qu'être favorable à l'aplatissement ultérieur, mais peut obliger à une recoloration future. En principe , il suffit que les pièces soient passées du noir ou du brun foncé au brun clair.

* Après rejet de la solution ( sans perte de la pièce, ce n'est pas toujours facile ! ), 2 ou 3 lavages rapides à l'eau, un lavage de 5 à 10 mn dans de l'eau additionnée d'un peu d'acide acétique ( du vinaigre blanc peut convenir ), suivi de 3 ou 4 lavages prolongés ( chaque fois 15 mn ) à l'eau, de préférence déminéralisée ; celle vendue pour les fers à repasser convient très bien.

* Facultatif :à ce stade, si le traitement alcalin a été trop poussé, il faut procéder à une recoloration par un séjour de 12 heures dans une solution à 1% de pyrogallol, suivi d'un lavage à l'eau alcalinisée puis à l'eau pure.

* Transfert de la pièce, par entraînement à l'eau, dans un verre de montre. Reprise sur un aiguille lancéolée, avec l'aide d' une autre aiguille.

* Transport et dépôt sur une lame porte-objet avec deux gouttes de liquide glycériné ( eau + alcool + glycérine à part égales ) choisi pour sa faible évaporation. Recouvrir d'une lamelle, contrôler au microscope. Si l'éclaircissement est jugé insuffisant, il faut reprendre le traitement à la soude, depuis le début....

* L'éclaircissement étant supposé suffisant, il faut procéder à l'évacuation des organes internes par aplatissement. Il suffit de charger la lamelle, progressivement, avec des objets de moindre dimension que cette dernière : d'abord une dizaine de grammes, puis lentement jusqu'à 50 grammes en quelques heures.
 Astuce :j 'utilise pour ce travail des plombs de pêche, coupés au milieu à la scie à métaux et polis sur du papier de verre très fin:

* Après un séjour sous pression de 24 heures , nouveau contrôle au microscope. Il peut être nécessaire, après enlèvement de la lamelle ( ajouter un peu d'eau ) de rouler avec précaution sur la pièce une petite baguette de verre. A la rigueur, reprendre le traitement à la soude.

* Après ouverture de la préparation ( ajouter un peu d'eau autour de la lamelle et soulever celle-ci avec une aiguille lancéolée en la maintenant par l'autre bord ), transférer la pièce dans un petit tube de verre à l'aide d'un peu d'eau.

* Remplacement de l'eau successivement par les produits suivants, avec séjour de 30 mn à quelques heures dans chacun d'eux :
- alcool dénaturé à 70° ( alcool à brûler + 0,3 volume d'eau pure )
- alcool dénaturé à 90-95°
- alcool éthylique à 95°

* Ensuite, il faut théoriquement de l'alcool absolu. C'est plus difficile à obtenir, et cet alcool se réhydrate facilement. On peut déshydrater l'alcool absolu à 95° ou plus par le sulfate de cuivre calciné. Bon ! N'en parlons plus ! Pour éviter le problème de l'alcool absolu, au moins pour les sujets envisagés, on peut passer de l'alcool à 90-95° au xylène phénolé:
Xylène : 30g
Phénol : 10g
L'un et l'autre peuvent s'obtenir chez un fournisseur de produits pour laboratoires. Le pharmacien doit disposer du phénol. C'est un produit  extrêmement dangereux. Eviter absolument tout contact avec la peau, ( gants ).Solide  jusque vers 40°, il faut le liquéfier au bain-marie tiède. Il s'hydrate facilement, ce qui abaisse son point de fusion, et s'il fond en dessous de 30 à 35 °, il devient inutilisable pour l'usage envisagé.

* Renouveler deux fois le traitement au xylène phénolé ( 5 à 10 mn  chaque fois ),puis laver 2 fois pendant 10mn au xylène pur. Le xylène est relativement toxique, prévoir une bonne aération, indispensable.
La moindre trace d'humidité dans le sujet provoque immanquablement un trouble. Si tel  est le cas, il faut recommencer le traitement au xylène phénolé...Le stade xylène est le dernier traitement (!) avant le montage au baume du Canada. On y accède donc, soit à partir de l'alcool absolu, soit à partir du xylène phénolé.

LE MONTAGE

* Préparer une lame et une lamelle très propres et bien sèches. déposer sur la lame une assez grosse goutte de baume du Canada ( avec un agitateur trempé dans le flacon ), et sur la lamelle une autre goutte, mais très petite.

* Transférer avec une aiguille lancéolée le sujet, du xylène sur la goutte de baume ( lame! ), en opérant avec la plus extrême délicatesse. Attention aux poussières  et aux petites bulles d'air. Prendre la lamelle avec une pince à lamelle ou une pince brucelles très fine, la retourner goutte en dessous et la déposer lentement sur l'ensemble goutte-sujet. Le baume commence à s'étaler, essayer de centrer la lamelle ( voir le gabarit que j'ai confectionné sur la photo plus haut ! ); éviter une migration trop prononcée du sujet en appuyant sur le bord de la lamelle vers lequel il se dirige.

* Contrôler au microscope.

* S'il y a un défaut, ajouter un peu de xylène, ouvrir la préparation,remettre le sujet dans le xylène et... recommencer !

* Si le résultat est valable, laisser l'ensemble à plat pendant plusieurs jours. Pour faciliter l'étalement du baume puis son durcissement, il est très favorable de pouvoir chauffer progressivement jusqu'à 40-45° et de maintenir quelque temps à cette valeur. C'est là que mon étuve construction maison ( voir article détaillé sur le site ! ) fait des merveilles et m'est devenue tout simplement indispensable !

* Comme déjà dit plus haut, il est très utile et même indispensable de lester la lamelle avec un poids de 5 à 50gr, progressivement et selon besoin, soit qu'il y ait un défaut de baume, soit que le sujet soit trop épais.
De toute façon, la charge est favorable, pour diminuer l'épaisseur des préparations, et elle doit toujours être maintenue jusqu'à refroidissement complet . Elle provoque généralement un débordement du baume.

* Si la préparation est bonne, mais avec un défaut ou un  excès de baume, on peut presque toujours rattraper l'erreur :
- Défaut : apporter avec une aiguille lancéolée, à la limite lame-lamelle un peu de baume fluidifié par addition faible de xylène. Le baume file sous la lamelle par capillarité et l'excès pourra être ensuite évacué.
- Excès : Après durcissement ( chauffage de quelques heures et refroidissement complet ), gratter le baume durci avec un scalpel: c'est facile sur la lame, beaucoup plus délicat sur la lamelle qui risque de se déplacer, ou pire, de se casser...Eliminer au mieux les fragments de baume,faire durcir à nouveau, puis effacer les dernières traces avec un coton-tige légèrement imbibé de xylène.

Voilà ! J'espère que vous ne trouverez pas ce tableau trop effrayant; je vous assure que le résultat en vaut la peine, et, une fois qu'on s'est organisé ...

Il y a évidemment une autre solution, plus simple, c'est la gélatine glycérinée. Par contre je vous déconseille formellement le sirop d'Apathy,( mélange de gomme arabique et de sucre de canne - voir Séguy tome 33 paragraphe 610 ) préconisé dans les vieux manuels, avec lequel apparaissent, tôt ou tard, des cristallisations, entre quelques mois et quelques années. Avec la gélatine glycérinée, la conservation n'est pas absolument garantie, mais au prix d'un bon lutage les préparations se conservent apparemment bien. On passe directement du stade précédant la déshydratation dans la technique précédente, c'est à dire du sujet aplati, vidé, au liquide glycériné ( eau + alcool + glycérine à parts égales ), puis après bon égouttage, à une goutte de gélatine glycérinée tiède sur une lame également tiède. Mise en place d'une lamelle, séjour éventuel, mais recommandé ,dans l'étuve à 35°, pression s'il y a lieu, refroidissement sous pression, nettoyage parfait des bords et lutage avec plusieurs couches fines de peinture glycérophtalique.
La gélatine glycérinée se trouvait dans le commerce, ce n'est plus le cas aujourd'hui car ce milieu tend à être abandonné, mais on peut la préparer facilement :

- 10g de gélatine que l'on fait ramollir dans 20g d'eau, puis que l'on chauffe au bain-marie jusqu'à liquéfaction, et on ajoute 50g de glycérine.
A la rigueur, on peut même utiliser les suppositoires à la glycérine, détournés de leur destination (!) ,qu'il suffit de faire fondre au bain-marie et c'est tout prêt !

LA PHOTO

Je pense , mais cela n'engage que moi, que la couleur n'apporte strictement rien aux photos de préparations d'insectes, ni au niveau de la lisibilité du document, ni à l'intérêt documentaire de celui-ci. Je fais donc toutes mes prises de vue en 24x36, avec un film noir et blanc grain fin ( 32-50 ISO ), que je passe au scanner dès qu'il est développé ( je fais le développement moi-même, ce qui est facile et pas cher ).
Sans aucun tirage, j'obtiens immédiatement des positifs numériques prêts à être utilisés !

J'utilise quand même de temps en temps la couleur, en cherchant des fonds colorés, en particulier avec la polarisation, ce qui rend les images peut-être plus attrayantes,mais pas plus " scientifiques " !
Vous verrez des exemples de tout cela dans la mini-galerie qui suit !

Voilà bien des occupations en perspective !