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Travaux Pratiques de Microscopie

TPM-2

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La Coloration de Gram

Généralités.

 

Certains genres de bactéries ont en commun une membrane qui retient certains colorants. Ils forment le groupe des bactéries Gram Positives (Gram +)

Toutes les autres bactéries soit qu'elles n'ont pas de membrane soit que la nature de leur membrane est totalement différentes se laissent décolorer par la méthode de Gram. Elle sont dites Gram négatives. (Gram -)

 

Matériel

  • Microscope biologique avec immersion.
  • Culture (ou prélèvement) bactérienne.
  • Lames dégraissées.
  • Pince à lames
  • Bec Bunsen (ou bien lampe à alcool)
  • Pissette d'alcool absolu ou alcool-acétone.
  • Pissette d'eau.
  • COLORANTS

    • Violet phéniqué (Nicole)
      • Violet de gentiane (cristal violet) 1 gramme
      • Alcool absolu...................... 10 ml
      • Eau phéniquée à 1%............... 90 ml
    • Liquide de Lugol (IKI)
      • Iode ................... 1 g
      • Iodure de potassium... 2 g
      • Eau distillée......... 300 ml (200 g d'après Nicole)
    • Solution de Fuchsine
      • Solution de fuchsine saturée dans l'alcool 10 ml
      • Eau distillée ................................90 ml
    • Alcool Absolu. ou bien
    • Alcool-Acétone (Nicole)
      • Alcool Absolu 5 Volumes
      • Acétone ......1 Volume


Composition du Kit de GRAM HUCKER (RAL)

    1. Cristal Violet Oxalate
    2. Liquide de Lugol stabilisé
    3. Différenciateur lent
    4. Safranine

 

AVERTISSEMENT :
 La manipulation de matériel infectant doit être effectué par du personnel qualifié en respectant les règles d'asepsie.


Protocole

 

  1. ÉTALEMENT.
    L'étalement doit se faire en couche mince, sur une lame dégraissée.

  2. DESSICCATION.
    Laisser sécher à l'air.

  3. FIXATION.
    Passer trois fois rapidement dans la flamme du bec Bunsen la face de la lame opposée à l'étalement. Ne pas trop insister sous peine de carboniser le prélèvement.
    On peut également fixer en laissant évaporer quelques gouttes d'alcool méthylique versées directement sur le prélèvement.
    A ce stade les germes ne sont plus considérés comme contaminants.

  4. COLORATION de GRAM.
          1. Déposer quelques gouttes de Violet
          2. Laisser agir 4 à 6 secondes
          3. Égoutter sans rincer.

          4. Déposer quelques gouttes de Lugol
          5. Laisser agir 4 à 6 secondes.
          6. Égoutter et recommencer avec le Lugol.
          7. Égoutter.

          8. Faire couler sur la lame (pas sur l'étalement) l'Alcool ou l'Alcool-Acétone.
            Jusqu'à disparition du Violet.

          9. Laisser agir quelques gouttes de Fuchsine 25 secondes.
          10. Laver.
          11. Sécher.


  5. EXAMEN.
    Examiner à l'objectif à immersion.
Commentaires


La coloration de Gram se fait en trois phases suivies d'une phase facultative de coloration du fond.

  • A-(1,2,3) Coloration au Violet. Tous les éléments sont colorés en Violet.

  • B- (4,5,6,7) Le Lugol fixe le Violet sur les structures membranaire des bactéries Gram+.Tous les éléments sont colorés en noir.


  • C-(8) Décoloration. Les bactéries Gram + sont colorés en violet foncé, les autres éléments ne sont pas colorés.

  • D-(9,10,11)Re coloration du fond à la Fuchsine. Les éléments tissulaires et les bactéries Gram- sont colorés en rose. Les Bactéries Gram+ sont colorés en violet.
Résultats
A suivre ....