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Travaux Pratiques de Microscopie

TPM-2

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Coloration au May-Grünwald-Giemsa (Pappenheim)

Généralités.

Le sang, tissus noble de notre organisme peut nous apporter de nombreux renseignements sur notre état de santé.
Nombreux d'entre-nous avons été (ou serons) confrontés à une feuille de résultats de laboratoire comportant une analyse appelée Numération Formule Sanguine.(NFS)
La NFS comprend une Numération et une Formule.

La Numération sanguine consiste à compter le nombre des éléments figurés du sang (Globules).
Le résultat est exprimé en éléments par mm3 (millimètre cube).

Hématies....................	4 500 000	-	5 000 000	/ mm3
Leucocytes..................	6 000	-	8 000	/ mm3
Plaquettes ..................	200 000	-	300 000	/ mm3

La Formule sanguine donne la proportion de chacun des types de globules blancs.

Polynucléaires neutrophiles	55	-	75	%
Polynucléaires éosinophiles	2	-	4	%
Polynucléaires basophiles	0.5	-	1	%
Lymphocytes (Petits + Grands)	20	-	35	%
Monocytes	6	-	10	%

Les NFS sont habituellement effectuées par des automates de laboratoire, mais l'étude fine des Formules sanguines se fait au microscope après coloration au May-Gründwald-Giemsa (MGG).

C'est la Coloration Panoptique de Pappenheim.

Matériel.

• Microscope biologique.
• Prélèvement sanguin.
  
• Lames dégraissées. Ou lamelles
• Pince à lames
• Pissette d'eau neutre.

• COLORANTS
  • May-Grünwald pur RAL
  • Giemsa-R RAL dilué au 1/10
    • Giemsa-R ........... 3 gouttes
    • Eau neutre ...........2 ml
  • Tampon phosphaté pH 7 (*AV)
    • Phosphate monopotassique 1 g
    • Phosphate disodique 5 g
    • Eau distillée 5000 ml

Protocole.

1. PRÉLÈVEMENT.
   Le prélèvement au laboratoire ou en clinique se fait au vacutainer sur sang veineux avec anticoagulant (K3 EDTA)
   Pour le microscopiste amateur, pratiquer un prélèvement capillaire à la pulpe du doigt.
   
   
2. FROTTIS
   Le frottis peut se pratiquer sur lame ou sur lamelle.
   
   1. FROTTIS SUR LAME.
      • Déposer une goutte de sang de taille moyenne à 1.5 cm du bord droit d'une lame dégraissée.
      • Étaler par capillarité la goutte au contact de l'arête d'une deuxième lame rodée tenue à 45 degrés.
      • Pousser rapidement la deuxième lame vers la gauche de la première lame en entraînant le sang qui s'étale en une couche mono cellulaire (Frottis).
        Si la goutte de sang est de taille convenable, le frottis doit se terminer à 1 cm environ du bord gauche de la lame.
      • Variante: on peut remplacer la deuxième lame par une lamelle couvre objet.
        
        
   2. FROTTIS AVEC LAMELLES.
      • Déposer une goutte de sang capillaire sur une lamelle couvre objet.
      • Poser une deuxième lamelle sur la goutte de sang à 45 degrés de la première.
      • Tirer rapidement sur un angle de la lamelle supérieure en maintenant la lamelle inférieure avec l'autre main.
        
        
3. DESSICCATION.
   Le frottis sèche rapidement à l'air a l'abri des poussières.
   
   
4. COLORATION au MGG.
   
   
   1. Coloration sur lame
      • Déposer 10 à 15 gouttes de May-Grünwald sur le frottis et couvrir pour éviter l'évaporation. Pendant 3 mn. C'est la Fixation.
      • Déposer 10 à 15 gouttes d'eau tamponnée et mélanger par rotation de la lame. 1 mn
      • Égoutter
      • Recouvrir de Giemsa dilué 15 mn. C'est la coloration.
      • Égoutter
      • Laver à l'eau neutre.
      • Sécher au papier Joseph.
        
        
   2. Coloration sur lamelles
      • La coloration est identique à la coloration sur lame mais on dispose les lamelles dans un verre de montre.
        
        
   3. Coloration en cuve
      • La coloration dans des cuve est légèrement différente de la coloration sur lame.
        Elle est précédée par une étape de fixation dans l'alcool.
        La deuxième cuve contient le May-Grünwald dilué à 50%
        
   
   
   
5. EXAMEN.
   Examen à l'objectif 40 X à hématologie ou
   Examiner à l'immersion 100 X et oculaires faibles
   Déplacer la lame en faisant des "créneaux" pour ne pas repasser au même endroit.
   Compter 100 leucocytes (ou mieux 200 ) ce qui donne immédiatement le résultat.
   Au laboratoire on utilisera un compteur de cellules.
   
   
6. CONSERVATION DES FROTTIS.
   Les frottis après examen à l'immersion sont couverts d'huile qui a tendance d'abord à ramasser poussières et fibres puis à sécher. De ce fait un ré-examen ultérieur de la lame est rendu difficile. Son nettoyage au xylène n'est pas satisfaisant.
   Une bonne habitude consiste à déposer une grosse goutte d'huile de cèdre sur le frottis et de poser par dessus une ou deux grosses lamelles contiguës.
   Au bout de quelques jours le frottis est transformé en préparation permanente qui se conserve indéfiniment. La présence de lamelle malgré son épaisseur ne nuit pas la mise au point lors d'un futur examen à l'immersion.
   

RÉSULTATS

GÉNÉRALITÉS SUR L'HÉMATOPOÏÈSE.

• L'Hématopoïèse est l'ensemble des processus biologiques ( différenciation, transformation, maturation ) aboutissant à la présence d'éléments figurés dans le sang (diabase). Cette succession de transformations pour chacun des éléments figurés constitue une lignée.
  
  
  • La Myélopoïèse .C'est la fabrication des cellules myéloïdes c'est à dire qui ont leur lignée dans la moelle osseuse. Elle concerne les hématies, les polynucléaires*, les monocytes et les plaquettes.
    • l'Erythropoïèse est la formation des globules rouges.
    • La Granulopoïèse est la fabrication des
      • polynucléaires neutrophiles
      • monocytes
      • polynucléaires éosinophiles
      • polynucléaires basophiles
    • La lignée Mégacaryoblastique aboutit aux plaquettes.
• La Lymphopoïèse C'est la fabrication des cellules lymphoïdes c'est à dire qui ont leur lignée dans la lymphe et les ganglions lymphatiques. Elle concerne les Lymphocytes.
  

*Les polynucléaires (granulocytes) n'ont qu'un seul noyau mais il est polylobé

Le Polynucléaire Neutrophile
	Origine: Précédé dans la moelle osseuse par le Myéloblaste,Promyélocyte neutrophile Myélocyte neutrophile et Métamyélocyte neutrophile. Description: Taille: 12-14 µ arrondi. Noyau: Polylobé 2-6 lobes (2-3 les plus nombreux) Cytoplasme: clair acidophile Granulations: neutrophiles violettes régulières tes fines et nombreuses
4 PN + Lymphocyte

Le polynucléaire Eosinophile
	Origine: Précédé dans la moelle osseuse par le Myéloblaste,Promyélocyte, éosinophile Myélocyte éosinophile et Métamyélocyte éosinophile. Description: Taille: 12-14µ arrondi. Noyau: 2-3 lobes Cytoplasme: clair,acidophile presque pas visible recouvert par les granulations Granulations: acidophiles, roses, rondes,nombreuses
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Le Polynucléaire Basophile
	Origine: Précédé dans la moelle osseuse par le Myéloblaste,Promyélocyte basophile Myélocyte basophile et Métamyélocyte basophile. Description: Taille: 11-13 µ arrondi Noyau: 2-4 lobes denses Cytoplasme: acidophile clair Granulations: très nombreuses pouvant recouvrir le noyau anguleuses bleu-violet foncé

Le Lymphocyte ( Petit )
	Origine: Précédé dans la moelle osseuse par le Lymphoblaste. Description: Taille: 9-11 µ arrondi Noyau: rond et dense Cytoplasme: basophile bleu clair Granulations: NÉANT

Le Grand Lymphocyte
	Origine: Précédé dans la moelle osseuse par le Lymphoblaste. Description: Taille: 10-15 µ Arrondi déformable( les bords épousent la forme des cellules mitoyennes). Noyau: rond ovale ou en drapeau Cytoplasme:bleu très clair Granulations: quelques rares granulations azurophiles en paquet

Le Monocyte
	Origine: Précédé dans la moelle osseuse par le Monoblaste et le Promonocyte (Monocyte jeune) Description: Taille: 18-21 µ arrondi très déformable Noyau: rond ou encoché Cytoplasme: basophile clair Granulations: très fines et très nombreuses azurophiles
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AUTRES ÉLÉMENTS FIGURES
	Les Hématies (Globules Rouges) et les Plaquettes sont visibles sur les lames colorées au MGG mais ne sont pas comptabilisées dans la Formule sanguine.

Hématies (Erythrocytes, Globules Rouges, GR)
	Origine: Précédé dans la moelle osseuse par le Proérythroblaste Erythroblaste basophile Erythroblaste polychromatophile Erythroblaste acidophile Réticulocyte Description: Taille: 7.2 µ biconcave Noyau: NÉANT Cytoplasme: Acidophile gris-rose centre clair Granulations: NÉANT(Présence d'un réseau de chromatine chez le Reticulocyte

Plaquettes (Thrombocytes, Globulins )
	Origine: Précédé dans la moelle osseuse par le Mégacaryoblaste Megacaryocyte basophile Mégacaryocyte granuleux Mégacaryocyte thrombocytogène Thrombocyte. Description: Taille: 1-3 µ Noyau: NÉANT Cytoplasme:Basophile clair Granulations: Azurophiles taille moyenne éparpillées

ÉLÉMENTS ANORMAUX
	Certains éléments de la moelle peuvent passer dans le sang soit exceptionnellement soit de manière permanente mais ceci sort du cadre de ce chapitre.